【摘要】：研究背景:急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是世界范圍內(nèi)死亡的主要原因。隨著冠脈介入治療的普及,絕大多數(shù)心�；颊呖赏ㄟ^(guò)冠脈血運(yùn)重建治療挽救瀕死的心肌,大大降低了臨床病死率。然而,這種再灌注過(guò)程本身亦可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷,即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury,myocardialI/R injury),常表現(xiàn)為心肌頓抑、心律失常和心肌能量代謝改變等等。心肌缺血再灌注損傷已成為患者從缺血后復(fù)流獲益的主要障礙,如何預(yù)防和減少再灌注損傷是臨床上亟待解決的問(wèn)題。免疫激活在心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)缺血的心肌恢復(fù)血流后,由于氧自由基的大量產(chǎn)生,受損的心肌細(xì)胞釋放內(nèi)源性的危險(xiǎn)信號(hào)招募炎癥細(xì)胞歸巢,啟動(dòng)/放大局部炎癥反應(yīng),造成心肌細(xì)胞繼發(fā)性損傷。單核巨噬細(xì)胞在缺血再灌注誘發(fā)的炎癥反應(yīng)中扮演重要的作用。起初巨噬細(xì)胞以M1型為主,能釋放多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)促進(jìn)吞噬死亡細(xì)胞。而隨著時(shí)間的推移,M1型細(xì)胞加重組織損傷、心肌凋亡的負(fù)面作用逐漸顯現(xiàn),巨噬細(xì)胞逐漸向M2型轉(zhuǎn)化,M2型巨噬細(xì)胞能夠大量合成與釋放抗炎細(xì)胞因子、免疫抑制因子和多種生長(zhǎng)因子,具有抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)心肌組織修復(fù)的功能。故如何在缺血再灌注后,促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1向M2型轉(zhuǎn)化,抑制過(guò)度激活的炎癥反應(yīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注和研究。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)是具有自我更新及多向分化潛能的成體干細(xì)胞,被廣泛應(yīng)用于受損心肌再生及修復(fù)領(lǐng)域。早期的研究發(fā)現(xiàn),MSC移植到缺血再灌注損傷后的心肌組織中,具有化成為心肌樣細(xì)胞的潛力。然而隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)MSC直接分化能力十分有限,其對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用多是通過(guò)旁分泌途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。外泌體是一種能被大多數(shù)細(xì)胞分泌的微小囊泡,直徑大約30-150nm,其內(nèi)包含有細(xì)胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸。目前認(rèn)為,外泌體是MSC細(xì)胞發(fā)揮旁分泌作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。故本研究擬探討MSC來(lái)源的外泌體是否通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極性的改變,對(duì)心肌缺血再灌注損傷起保護(hù)作用,并對(duì)可能的分子機(jī)制行初步探討,為其應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。研究方法:(1)利用超速離心法從MSC培養(yǎng)上清液中提取外泌體,并利用納米顆粒跟蹤分析技術(shù)、透射電鏡及免疫印跡分析對(duì)提取出的外泌體進(jìn)行鑒定。(2)構(gòu)建小鼠心肌缺血再灌注模型,再灌注后即刻心肌內(nèi)注射MSC外泌體,觀察MSC外泌體是否對(duì)心肌缺血再灌注損傷及其誘導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng)具有治療作用。(3)通過(guò)給小鼠尾靜脈注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞,觀察巨噬細(xì)胞清除后MSC外泌體對(duì)心肌的保護(hù)作用是否被削弱。(4)運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、免疫印跡分析等方法在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中觀察MSC外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞表型的影響。(5)通過(guò)對(duì)MSC外泌體進(jìn)行miRNA測(cè)序并結(jié)合既往文獻(xiàn),篩選出其中可能參與巨噬細(xì)胞極化調(diào)節(jié)的miRNA,并通過(guò)miRNA功能學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。(6)結(jié)合miRNA靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果,通過(guò)免疫印跡分析等實(shí)驗(yàn)對(duì)其下游通路進(jìn)行探討。結(jié)果:(1)利用超速離心法可成功提取出直徑在30-150nm,具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu),表達(dá)特殊表面標(biāo)記的外泌體。(2)再灌注后即刻心肌內(nèi)注射MSC外泌體能夠改善小鼠心功能,減少心梗面積,抑制心室重構(gòu),減輕心肌組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)。(3)巨噬細(xì)胞被清除后,MSC外泌體對(duì)心肌缺血再灌注損傷的治療作用被削弱,提示巨噬細(xì)胞可能是其發(fā)揮心肌保護(hù)作用的靶點(diǎn)。(4)在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中均觀察到MSC外泌體可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化。(5)MSC外泌體中富含miR-182,通過(guò)miRNA功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-182能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化。當(dāng)抑制MSC外泌體中miR-182的功能后,可以觀察到MSC外泌體促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化作用被削弱。(6)MSC外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)miR-182抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路,同時(shí)激活PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化的作用。結(jié)論:MSC外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)miR-182作用于巨噬細(xì)胞,調(diào)節(jié)TLR4/NF-KB/PI3K/Akt信號(hào)通路,促進(jìn)心肌缺血再灌注后巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化,抑制心肌炎癥反應(yīng),從而減輕心肌缺血再灌注損傷。
【圖文】：

心肌缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)X23]

圖１．２心肌缺血再灌注后巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化過(guò)程［３１】逡逑既往研究表明，心梗后給予巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ邋ｃｏｌｏｎｙ逡逑ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ邋ｆａｃｔｏｒ，Ｍ－ＣＳＦ）能夠增強(qiáng)心肌內(nèi)巨噻細(xì)胞的浸潤(rùn)，，從而改善心功能，逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R542.22

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