【摘要】：研究背景內(nèi)膜新生是血管內(nèi)膜層的異常生長(zhǎng),是一種常見(jiàn)的嚴(yán)重病理生理過(guò)程,是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和支架內(nèi)再狹窄的主要原因。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)是再狹窄和動(dòng)脈粥樣硬化病變中新生內(nèi)膜的主要成分,其參與新生內(nèi)膜形成的具體分子機(jī)制尚不完全清楚。目前認(rèn)為,在損傷或其他刺激因素作用下,VSMC轉(zhuǎn)化表型,增殖,遷移和分泌細(xì)胞外基質(zhì),導(dǎo)致新生內(nèi)膜形成。在新生內(nèi)膜形成期間,局部產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子,例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)也參與了該過(guò)程。目前,抑制新生內(nèi)膜形成的防治手段仍非常有限。因此,進(jìn)一步闡明控制VSMC生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的機(jī)制,對(duì)于理解此類血管增殖性疾病的發(fā)病機(jī)理和進(jìn)程,并探尋治療這些疾病新的分子靶標(biāo)是非常必要的。轉(zhuǎn)位蛋白(translocator protein,TSPO)是分布在線粒體外膜中的蛋白質(zhì)。不同生物的TSPO蛋白在序列和功能上高度保守。在理化因素或致病因子的刺激下,細(xì)胞中TSPO的表達(dá)容易發(fā)生變化。TSPO在細(xì)胞凋亡,炎癥,HIV生物合成,癌癥和阿爾茨海默病中發(fā)揮重要作用。而TSPO參與多種心血管疾病過(guò)程的作用越來(lái)越受到研究者的關(guān)注,如心肌缺血再灌注損傷,心律失常,心臟肥大和動(dòng)脈粥樣硬化等。PK11195和Ro5-4864是兩種被最廣泛研究的TSPO配體。體外研究表明PK11195與富含巨噬細(xì)胞的人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊結(jié)合并大量聚集,放射性標(biāo)記的PK11195已被用于動(dòng)脈粥樣硬化成像檢測(cè)和疾病診斷。TSPO調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖的作用已被證實(shí),且在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊區(qū)域TSPO表達(dá)顯著上調(diào),基于此,我們推測(cè)TSPO可能與血管成形術(shù)后VSMC的異常增殖有關(guān)。研究目的1、鑒定球囊損傷的大鼠頸動(dòng)脈和PDGF-BB誘導(dǎo)的A10細(xì)胞的VSMC中TSPO的表達(dá);2、研究TSPO在PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移中的作用;3、探討TSPO配體對(duì)體外和體內(nèi)VSMC增殖和遷移的影響和潛在機(jī)制。研究方法在成年雄性SD大鼠(250±50g體重)中,利用球囊損傷誘導(dǎo)建立左頸動(dòng)脈內(nèi)膜新生模型。分別在球囊損傷后1天,7天,14天和21天后處死大鼠并收集頸動(dòng)脈標(biāo)本。切片后行免疫熒光染色觀察α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,a-SMA)和TSPO的表達(dá);應(yīng)用免疫印跡和PCR法檢測(cè)TSPO蛋白和mRNA在頸動(dòng)脈組織勻漿中的表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)中,用PDFG-BB刺激A10細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和遷移。用免疫印跡測(cè)定細(xì)胞裂解液中TSPO的表達(dá);用細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)和MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖水平;用劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移水平。利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法進(jìn)行功能獲得性實(shí)驗(yàn),探索TSPO在PDGF-BB介導(dǎo)的A10細(xì)胞增殖和遷移中的作用。應(yīng)用TSPO特異性配體PK11195和Ro5-4864,觀察它們對(duì)PDGF-BB介導(dǎo)的A10細(xì)胞增殖和遷移的影響,采用MTT,劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell等方法檢測(cè)細(xì)胞增殖和遷移水平的差異。此外,我們用免疫印跡法測(cè)定了細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E,以及細(xì)胞增殖標(biāo)志蛋白增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表達(dá)情況。為了揭示TSPO配體抑制VSMC異常增生的作用機(jī)制,我們通過(guò)測(cè)定磷酸化AMP依賴的蛋白激酶(adenosine 5‘-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)與總AMPK的比值觀察AMPK活性的改變,并應(yīng)用AMPK特異性抑制劑Compound C進(jìn)一步證實(shí)了AMPK信號(hào)通路在PK11195抑制A10細(xì)胞增殖和遷移中的作用。最后,我們?cè)赟D大鼠中研究了PK11195對(duì)球囊損傷誘導(dǎo)的內(nèi)膜新生的保護(hù)作用。在大鼠頸動(dòng)脈建立球囊損傷內(nèi)膜新生模型的同時(shí),給予腹膜內(nèi)注射PK11195(3mg/kg,1次/3天)。在球囊損傷14天后,處死大鼠并收集頸動(dòng)脈進(jìn)行切片和HE染色,計(jì)算內(nèi)膜與中膜的厚度比以評(píng)估新生內(nèi)膜形成;利用PCNA免疫熒光染色評(píng)估VSMC增殖情況;利用免疫印跡法測(cè)定a-SMA的表達(dá)。結(jié)果細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)TSPO在異常增生VSMC中的表達(dá)明顯上調(diào);PKC/MAPK通路介導(dǎo)了PDGF-BB引起的A10細(xì)胞TPSO生成。過(guò)表達(dá)TSPO顯著促進(jìn)A10細(xì)胞增殖和遷移;相反,通過(guò)siRNA下調(diào)TSPO表達(dá),以及TSPO配體PK11195或Ro5-4864(10ng/ml)處理,抑制A10細(xì)胞增殖和遷移。在機(jī)制研究中,我們發(fā)現(xiàn)PK11195能誘導(dǎo)AMPK活化;并且,AMPK特異性抑制劑Compound C消除了PK11195對(duì)PDGF-BB介導(dǎo)的A10細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。重要的是,給予大鼠腹膜內(nèi)注射PK11195(3mg/kg,1次/3天),持續(xù)2周給藥,能逆轉(zhuǎn)球囊損傷引起的VSMC表型轉(zhuǎn)換和增殖反應(yīng),從而減輕大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜新生的嚴(yán)重程度。結(jié)論:TSPO是介導(dǎo)VSMC增殖和遷移的關(guān)鍵蛋白,PKC/MAPK通路介導(dǎo)了其增強(qiáng)表達(dá)的過(guò)程;TSPO特異性配體PK11195通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào),逆轉(zhuǎn)球囊損傷引起的VSMC表型轉(zhuǎn)換,抑制VSMC的增殖反應(yīng),減輕球囊損傷誘導(dǎo)的大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜新生。
【圖文】：

球囊損傷后血管病理形態(tài)學(xué)改變（HE染色）

27 1B. 新生內(nèi)膜與中膜厚度比值的統(tǒng)計(jì)結(jié)（與 Sham 組比較，*P<0.05；n=5）膜新生血管中的定位及表達(dá)7 天、14 天和 21 天，收集大鼠頸動(dòng)WB 檢測(cè)，以及 mRNA 的 PCR 檢-SMA 共定位，熒光量統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明顯增強(qiáng)，a-SMA 表達(dá)明顯降低、7 天、14 天及 21 天組 TSPO 蛋 2C 和 2D。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2616983