【摘要】：研究背景根據(jù)2017年全球疾病負(fù)擔(dān)報(bào)告,心血管疾病(Cardiovascular diseases)造成了將近1,800萬(wàn)人死亡,較10年前增長(zhǎng)了約21.1%,心血管疾病已經(jīng)連續(xù)數(shù)年成為人類(lèi)健康的頭號(hào)殺手。AS作為心血管疾病的主要病理基礎(chǔ),其特點(diǎn)是受累動(dòng)脈從內(nèi)膜開(kāi)始,先后出現(xiàn)脂質(zhì)沉積、纖維增生及鈣質(zhì)沉著,動(dòng)脈中膜逐漸退變及鈣化,并可發(fā)生斑塊內(nèi)出血、斑塊破裂及局部血栓形成。研究表明,臨床心血管事件多由不穩(wěn)定斑塊引起,AS斑塊的穩(wěn)定性主要由脂質(zhì)核心大小、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥反應(yīng)程度以及纖維膜的厚薄決定。因此,探討影響動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的因素及其具體機(jī)制對(duì)AS的防治具有重要的臨床意義。易損斑塊往往具有較薄的纖維帽,而纖維帽的形成及其完整性的維持主要依靠ECM,血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)為ECM的主要來(lái)源。膠原為ECM的主要成分,其中又以Ⅰ型及Ⅲ型膠原表達(dá)量最高。膠原的代謝包括合成與降解兩部分。近年來(lái),對(duì)膠原代謝的研究主要集中在其降解過(guò)程,對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)膠原合成過(guò)程及其調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究較少。膠原的合成需要羥化酶及糖基化酶的輔助,其中輔氨酰-4-羥化酶(P4H)對(duì)膠原形成穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)具有重要作用。miRNA是一類(lèi)非編碼RNA,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)它們參與了多種生理以及病理過(guò)程的調(diào)節(jié)。已有多種miRNA被證實(shí)在AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了重要的調(diào)控作用。miR-1]24-3p為一種在體內(nèi)多種器官組織中表達(dá)的miRNA,最初在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)被發(fā)現(xiàn),可以促進(jìn)神經(jīng)元的成熟,與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān);還被證實(shí)能夠抑制多種腫瘤的增殖、遷移,從而起到抑癌作用。最近有研究發(fā)現(xiàn),miR-124-3p的血清含量在吸煙的冠心病患者中,與心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)成正相關(guān)。然而其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的作用及機(jī)制尚未明了,仍待進(jìn)一步研究。研究目的1.明確miR-124-3p對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中組織成分及穩(wěn)定性的影響;2.觀(guān)察miR-124-3p在斑塊中的分布并探討miR-124-3p對(duì)血管平滑肌細(xì)胞膠原代謝的影響及其機(jī)制。研究方法1.Lenti-miR-124-3p慢病毒的構(gòu)建應(yīng)用慢病毒載體pGLV3/H1/GFP+Puro構(gòu)建小鼠miR-124-3p過(guò)表達(dá)(miR-124-3p mimic)慢病毒及miR-124-3p抑制(miR-124-3p inhibitor)慢病毒。2.構(gòu)建動(dòng)物模型60只8周齡ApoE-/-雄性小鼠,2周普通飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)后改用高脂飼料喂養(yǎng)12周,隨機(jī)分3組,于取材前四周行尾靜脈注射:(1)空白對(duì)照組(n=20):其中18只注射2×107TU的Lenti-GFP(NC組),另隨機(jī)選取2只注射等量生理鹽水(NS組)用于檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;(2)miR-124-3p過(guò)表達(dá)組(n=20):注射2×107TU攜帶miR-124-3p mimic的慢病毒;(3)miR-124-3p抑制組(n=20):注射2×107TU攜帶miR-124-3p inhibitor的慢病毒。2周后檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效率,4周后取材。3.動(dòng)物取材采用腹腔注射戊巴比妥鈉法麻醉小鼠,稱(chēng)量體重后固定。心尖取血處死小鼠,留取血清,檢測(cè)血脂水平。剝離小鼠主動(dòng)脈,并留取心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟,根據(jù)需要選擇甲醛固定或者液氮(后轉(zhuǎn)移至-80℃)保存。4%多聚甲醛固定主動(dòng)脈根24h后流水沖洗,用OCT進(jìn)行包埋,-80℃保存。染片前用冰凍切片機(jī)行厚度5μm連續(xù)切片。4.組織蛋白提取及濃度測(cè)定取-80℃保存的小鼠主動(dòng)脈弓段,按照每1mg組織加入110μl蛋白裂解液(RIPA)將組織浸泡在相應(yīng)體積的RIPA中,用組織勻漿機(jī)勻漿后消化,離心后取上清液。采用BCA試劑盒測(cè)量蛋白濃度,然后加入蛋白上樣緩沖液,煮沸變性。5.蛋白質(zhì)印跡法(Western blot,WB)根據(jù)測(cè)量的蛋白濃度計(jì)算相應(yīng)上樣體積,最終按1Omg/孔點(diǎn)樣,經(jīng)電泳及濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜后,孵育一抗于4℃過(guò)夜,次日洗膜,孵育二抗后行化學(xué)發(fā)光,留取圖片并分析條帶灰度值。6.大體油紅O染色將固定后的整條主動(dòng)脈縱向剖開(kāi),用油紅O染液于室溫下浸染2個(gè)小時(shí),利用溫水分化,后于大體顯微鏡下觀(guān)察并剝離血管外膜,將血管展平后拍照。7.組織切片染色主動(dòng)脈根部冰凍切片染色觀(guān)察AS斑塊相關(guān)指標(biāo)。利用HE染色、油紅O染色、天狼猩紅染色顯示斑塊大小及脂質(zhì)、膠原含量,利用巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的特異性抗體MOMA-2及α-SMA進(jìn)行免疫組化染色觀(guān)察斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的含量。此外,還利用Ⅰ型及Ⅲ型膠原抗體及P4HA1抗體、MMP2及MMP9抗體對(duì)斑塊內(nèi)的相應(yīng)蛋白進(jìn)行免疫組化染色以顯示其表達(dá)量。8.熒光原位雜交(FISH)與免疫熒光染色設(shè)計(jì)地高辛標(biāo)記的miR-124-3p探針,利用熒光原位雜交技術(shù)顯示斑塊內(nèi)miR-124-3p的分布,同時(shí)利用平滑肌細(xì)胞(α-SMA)、內(nèi)皮細(xì)胞(endomucin)及巨噬細(xì)胞(MOMA-2)的特異性抗體行免疫熒光染色后與miR-124-3p進(jìn)行共定位,觀(guān)察miR-124-3p在不同種類(lèi)細(xì)胞內(nèi)的分布情況。9.平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)及處理實(shí)驗(yàn)使用的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司,細(xì)胞培養(yǎng)基亦采用同公司生產(chǎn)的SMCM。細(xì)胞于37℃,含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。構(gòu)建體外轉(zhuǎn)染用的miR-124-3p mimic及inhibitor序列,利用Lipofectamine 2000對(duì)平滑肌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,調(diào)控細(xì)胞內(nèi)miR-124-3p表達(dá)。10.逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(RT-qPCR)動(dòng)物組織RNA利用Qiagen的miRNA提取試劑盒提取,步驟按照說(shuō)明書(shū)。細(xì)胞則利用TRIzol法提取總RNA。利用Nanodrop測(cè)定RNA濃度后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明,對(duì)mRNA及miR-124-3p分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。之后利用SYBR及特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。測(cè)定Ⅰ型、Ⅲ型膠原及P4HA1的mRNA以及miR-124-3p的表達(dá)情況。11.構(gòu)建含有P4HA1 mRNA 3'UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建含有人的野生型P4HA1mRNA 3'非編碼區(qū)(3'UTR)序列和突變型P4HA1 mRNA 3'UTR序列的雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒:P4HA1 3'UTR wild和P4HA1 3'UTR mut。利用 Lipofectamine 2000將miR-124-3p mimic及其對(duì)照和兩種質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染HASMCs,48h后檢測(cè)熒光素酶活性。12.RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)miRNA通過(guò)與Ago蛋白形成沉默復(fù)合體與靶基因的mRNA相結(jié)合,其中Ago2為最常見(jiàn)的載體蛋白。分別將轉(zhuǎn)染了miR-124-3p mimic及其對(duì)照的平滑肌細(xì)胞通過(guò)試劑盒行RIP實(shí)驗(yàn),利用Ago2蛋白抗體拉下與Ago2結(jié)合的RNA,再行RT-qPCR檢測(cè)其中P4HA1 mRNA的含量。13.統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用Graphpad Prism 6.0做統(tǒng)計(jì)分析及統(tǒng)計(jì)圖表繪制。配對(duì)或非配對(duì)t檢驗(yàn)用于兩組樣本間比較,多樣本間比較應(yīng)用ANOVA單因素方差分析,認(rèn)定P0.05為具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果1.動(dòng)物一般情況3組ApoE-/-小鼠的體重及血清血脂水平均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示miR-124-3p對(duì)小鼠的血脂及體重?zé)o明顯影響。2.慢病毒轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)效率檢測(cè)慢病毒經(jīng)尾靜脈注射兩周后取NC組及NS組各2只小鼠行主動(dòng)脈根部冰凍切片觀(guān)察,可見(jiàn)與NS組相比,注射空白慢病毒的NC組斑塊內(nèi)出現(xiàn)明顯綠色熒光,表明轉(zhuǎn)染有效。慢病毒注射四周后取材,分別取NC組、miR-124-3p mimic組及miR-124-3p inhibitor組小鼠各3只,主動(dòng)脈弓段提RNA并行RT-qPCR檢測(cè)miR-124-3p水平。與NC組相比,miR-124-3p mimic組miR-124-3p表達(dá)水平上調(diào),miR-124-3p inhibitor組表達(dá)下調(diào)。證明利用慢病毒對(duì)血管miR-124-3p的表達(dá)調(diào)控有效。3.miR-124-3p可增加斑塊易損性3組小鼠主動(dòng)脈根部行冰凍切片,染色結(jié)果顯示:經(jīng)大體油紅O及HE染色可見(jiàn)斑塊面積沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;然而,染色顯示與NC組相比,miR-124-3p mimic組內(nèi)膠原含量減少、斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞含量下降,而miR-124-3p inhibitor組斑塊內(nèi)膠原含量增加、平滑肌細(xì)胞含量增加;此外,3組間脂質(zhì)含量及巨噬細(xì)胞含量無(wú)明顯組間差異。4.miR-124-3p抑制斑塊內(nèi)Ⅰ型及Ⅲ型膠原的表達(dá)主動(dòng)脈根冰凍切片的免疫組化染色顯示,與NC組相比,miR-124-3p mimic組斑塊內(nèi)的Ⅰ型及Ⅲ型膠原表達(dá)減少,miR-124-3p inhibitor組斑塊內(nèi)Ⅰ型及Ⅲ型膠原表達(dá)增加。我們還檢測(cè)了斑塊內(nèi)膠原合成限速酶P4HA1及降解相關(guān)酶MMP2、MMP9的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)miR-124-3p過(guò)表達(dá)組P4HA1表達(dá)含量下降而miR-124-3p抑制組P4HA1表達(dá)含量上升,MMP2及MMP9表達(dá)未見(jiàn)明顯組間差異。5.miR-124-3p主要分布在平滑肌細(xì)胞中取NC組小鼠主動(dòng)脈根部冰凍切片,FISH及免疫熒光染色共定位顯示,在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中,miR-124-3p與α-SMA產(chǎn)生的熒光共定位數(shù)量最多,表明在斑塊中,miR-124-3p主要分布在平滑肌細(xì)胞內(nèi)。6.miR-124-3p降低平滑肌細(xì)胞內(nèi)膠原及P4HA1的表達(dá)體外培養(yǎng)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染miR-124-3p mimic,miR-124-3p inhibitor或?qū)φ?NC)后,WB結(jié)果顯示相較于NC組,miR-124-3p mimic組平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型及Ⅲ型膠原表達(dá)減少,P4HA1表達(dá)減少,而miR-124-3p inhibitor組Ⅰ型及Ⅲ型膠原表達(dá)增加,P4HA1表達(dá)增加。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP2及MMP9的表達(dá)量,組間未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。7.P4HA1是miR-124-3p的靶蛋白經(jīng)軟件預(yù)測(cè),人及小鼠P4HA1 mRNA的3'UTR區(qū)均存在miR-124-3p的可能結(jié)合位點(diǎn)。經(jīng)體外HASMCs的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示,共同轉(zhuǎn)染miR-124-3p mimic與野生型P4HA1 3'UTR雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的細(xì)胞中,螢火蟲(chóng)熒光素酶相對(duì)表達(dá)量下降,證實(shí)miR-124-3p可與P4HA1 mRNA的3'UTR端直接結(jié)合。此外,RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染了miR-124-3p mimic的平滑肌細(xì)胞中被Ago2抗體拉下的RNA中P4HA1 mRNA的表達(dá)量較轉(zhuǎn)染對(duì)照的細(xì)胞顯著增加,提示miR-124-3p可以增加P4HA1 mRNA與Ago2的結(jié)合,抑制了P4HA1 mRNA的轉(zhuǎn)錄后活性。結(jié)論1.miR-124-3p可通過(guò)降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞及膠原含量降低其穩(wěn)定性;2.斑塊中miR-124-3p主要分布在平滑肌細(xì)胞中,并通過(guò)作用于P4HA1影響Ⅰ型及Ⅲ型膠原合成。研究背景炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一,傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素如高脂血癥、高血壓、糖尿病等均可通過(guò)炎癥促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展,在這些過(guò)程中有多種炎癥細(xì)胞、炎癥因子參與。IL-1β在AS過(guò)程中起到重要作用,可以激活下游的IL-6、TNF-α等二級(jí)炎癥因子,促進(jìn)炎癥反應(yīng)的放大效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證實(shí),IL-1β或其受體IL-1R敲除的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊明顯變小。我們前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),miR-124-3p通過(guò)作用于平滑肌細(xì)胞內(nèi)膠原合成限速酶P4HA1影響膠原合成。炎癥與膠原合成也密切相關(guān),有研究證實(shí),IL-1β可以激活基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs),從而加速膠原的降解,使AS斑塊穩(wěn)定性下降。目前IL-1β的抗體逐漸開(kāi)始應(yīng)用于臨床治療,CANTOS研究顯示,IL-1β的抗體Canakinumab可顯著降低心血管病的風(fēng)險(xiǎn)。然而針對(duì)Canakinumab在ApoE-/-小鼠晚期AS斑塊中作用的實(shí)驗(yàn)顯示,IL-1β抗體的應(yīng)用使晚期斑塊內(nèi)膠原及平滑肌細(xì)胞含量減少。因此,IL-1β對(duì)膠原代謝的具體調(diào)控機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。miRNA參與到多種病理生理過(guò)程中,發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)在不同的細(xì)胞中,炎癥因子可以通過(guò)多種miRNA影響MMP及TIMP家族的酶表達(dá)及活性。但I(xiàn)L-1β及其下游的TNF-α、IL-6等炎癥因子是否可以引起miR-124-3p的改變,以及通過(guò)miR-124-3p對(duì)膠原合成過(guò)程的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。研究目的1.明確炎癥因子IL-11β、TNF-α、IL-6刺激對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)miR-124-3p表達(dá)的影響;2.探討miR-124-3p是否參與了IL-1β對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)膠原代謝的調(diào)節(jié)過(guò)程;3.探討IL-1β調(diào)節(jié)miR-124-3p表達(dá)的分子機(jī)制。研究方法1.體外人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)的培養(yǎng)HASMCs購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司,其專(zhuān)用平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基(SMCM)亦夠自同一公司。按照操作規(guī)范進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇與傳代,細(xì)胞培養(yǎng)于37℃,5%CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。6-10代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。2.炎癥因子刺激平滑肌細(xì)胞觀(guān)察miR-124-3p表達(dá)6-10代HASMCs種板后給予TNF-α 100ng/ml刺激0、1、3、6h;給予IL-6100ng/ml刺激0、1、3、6h;給予IL-1p 1Ong/ml刺激0、1、3、6、12、24h,觀(guān)察不同炎癥因子在不同時(shí)間點(diǎn)是否對(duì)miR-124-3β表達(dá)產(chǎn)生影響,收集細(xì)胞后提RNA,利用RT-qPCR檢測(cè)miR-124-3p的表達(dá)水平。明確IL-1β刺激引起miR-124-3p表達(dá)改變的合適時(shí)間后,選擇0、2.5、5、10ng/ml的IL-1β刺激HASMCs 6h,明確IL-1β刺激引起miR-124-3p表達(dá)改變的合適濃度。選擇適宜的刺激時(shí)間及濃度,用于后續(xù)研究。3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染6-10代HASMCs種板后利用lipo2000進(jìn)行miR-124-3p mimic、miR-124-3p inhibitor或?qū)φ盏霓D(zhuǎn)染,依照實(shí)驗(yàn)分組給予刺激,轉(zhuǎn)染24-48h收集細(xì)胞。6-10代HASMCs種板后利用lipo2000進(jìn)行c-Rel siRNA或c-Rel過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染,按照分組給予相應(yīng)刺激,轉(zhuǎn)染24-48h后收集細(xì)胞。4.逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)細(xì)胞刺激24h后利用TRIzol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)得到cDNA后用SYBR Green熒光定量試劑盒進(jìn)行qPCR,檢測(cè)miR-124-3p及c-Rel mRNA等RNA含量。5.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot,WB)細(xì)胞刺激結(jié)束后利用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白,4℃ 14000rpm離心10min,取上清,加入5×蛋白上樣緩沖液,99℃ 10min蛋白變性。配制凝膠,按照順序點(diǎn)樣后電泳,利用半干轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)膜,封閉后于4℃孵育一抗過(guò)夜,次日洗膜后于室溫孵育二抗1h,洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型、Ⅲ型膠原,P4HA1,c-Rel等蛋白的表達(dá)情況。6.ELISA檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)IL-1β刺激后收集細(xì)胞培養(yǎng)基,利用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其中Ⅰ型前膠原的含量。7.熒光素酶實(shí)驗(yàn)構(gòu)建含有miR-124-3p啟動(dòng)子全長(zhǎng)的螢火蟲(chóng)熒光素酶基因報(bào)告質(zhì)粒(Promoter),將其與海腎熒光素酶質(zhì)粒(pRL-TK)共同轉(zhuǎn)染HASMCs 48h后用IL-1β刺激6h,利用雙熒光素酶(DLR)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶相對(duì)強(qiáng)度。Promoter與pRL-TK共同轉(zhuǎn)染HASMCs,與此同時(shí),用c-Rel siRNA及其對(duì)照或pEGFP-c-Rel及其對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞,48h后利用DLR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光強(qiáng)度。8.統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及統(tǒng)計(jì)圖的繪制。兩樣本間比較使用非配對(duì)t檢驗(yàn),多樣本間比較使用ANOVA單因素方差分析,P0.05認(rèn)為存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果1.IL-1β上調(diào)HASMCs中miR-124-3p的表達(dá)給予不同時(shí)間梯度的TNF-α、IL-6及IL-1β刺激HASMCs,提RNA后行RT-qPCR,結(jié)果顯示TNF-α與IL-6對(duì)miR-124-3p表達(dá)的影響均不明顯;而給予IL-1β刺激后,與Oh相比,6h后平滑肌細(xì)胞中miR-124-3p表達(dá)明顯升高。給予不同濃度的IL-1β刺激HASMCs 6h,與Ong/ml相比,IL-1β可在1Ong/ml明顯上調(diào)miR-124-3p的表達(dá)。2.IL-1β使平滑肌細(xì)胞前膠原及膠原表達(dá)減少Elisa結(jié)果顯示IL-1β刺激平滑肌細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的Ⅰ型前膠原含量較對(duì)照組明顯減少。細(xì)胞提蛋白后用Western blot檢測(cè)其中Ⅰ型及Ⅲ型膠原含量,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,IL-1β刺激組細(xì)胞內(nèi)的Ⅰ型及Ⅲ型膠原明顯減少。3.miR-124-3p參與IL-1β誘導(dǎo)的HASMCs膠原合成抑制HASMCs轉(zhuǎn)染miR-124-3p inhibitor 24h后給予IL-1β 10ng/ml刺激,細(xì)胞提蛋白行Western blot,結(jié)果顯示,miR-124-3p inhibitor能夠一定程度緩解IL-1β對(duì)膠原的下調(diào)作用。此外,HASMCs轉(zhuǎn)染miR-124-3p mimic或inhibitor后給予IL-1β 10ng/ml刺激,Western結(jié)果顯示miR-124-3p mimic可使IL-1β對(duì)P4HA1的下調(diào)作用進(jìn)一步增加,而miR-124-3p inhibitor可緩解這一下調(diào)作用。4.IL-1β通過(guò)上調(diào)c-Rel促進(jìn)miR-124-3p的表達(dá)Western blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β刺激HASMCs后細(xì)胞內(nèi)c-Rel的蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示,刺激1h后c-Rel表達(dá)已上升,3h后c-Rel的表達(dá)達(dá)高峰,6h后逐漸下降。向HASMCs內(nèi)轉(zhuǎn)染c-Rel siRNA可以抑制IL-11β引起的miR-124-3p表達(dá)上調(diào),而向HASMCs內(nèi)轉(zhuǎn)染c-Rel過(guò)表達(dá)質(zhì)粒則可進(jìn)一步增加miR-124-3p的表達(dá)。向HASMCs內(nèi)轉(zhuǎn)染c-Rel siRNA后Western blot結(jié)果顯示與對(duì)照組相比c-Rel小干擾組P4HA1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 的表達(dá)均增多。而向 HASMCs內(nèi)轉(zhuǎn)染c-Rel過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后Western blot檢結(jié)果顯示與對(duì)照質(zhì)粒組相比,c-Rel過(guò)表達(dá)組P4HA1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達(dá)均減少。5.miR-124-3p是c-Rel的靶基因?qū)iR-124-3p Promoter質(zhì)粒與pRL-TK共同轉(zhuǎn)染HASMCs 48h后用 IL-1β刺激6h,DLR檢測(cè)結(jié)果顯示,IL-1β可使螢火蟲(chóng)熒光素酶相對(duì)活性增強(qiáng),提示IL-1β可以激活miR-124-3p啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。此外,Promoter與pRL-TK共同轉(zhuǎn)染HASMCs,與此同時(shí),用c-Rel siRNA及其對(duì)照或pEGFP-c-Rel及其對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞,DRL檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染c-Rel siRNA可以使螢火蟲(chóng)熒光素酶活性下降;而轉(zhuǎn)染pEGFP-c-Rel質(zhì)粒,可以使螢火蟲(chóng)熒光素酶活性升高,提示c-Rel可以增強(qiáng)miR-124-3p啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)論1.IL-1β上調(diào)平滑肌細(xì)胞中miR-124-3p的表達(dá);2.miR-124-3p參與了IL-1β對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)膠原表達(dá)的調(diào)節(jié);3.IL-1β通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子c-Rel增強(qiáng)miR-124-3p的轉(zhuǎn)錄活性。
【圖文】：

６０只８周齡雄性ＡｐｏＥ？＂小鼠全程高脂喂養(yǎng)構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型，逡逑邐８周后行經(jīng)尾靜脈＾ｔｉｌ病毒轉(zhuǎn)染邐逡逑ｎｅｇａｔｉｖｅ邐ｍｉＲ－１２４－３ｐ邐ｍｉＲ－１２４－３ｐ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邋組邐ｍｉｍｉｃ邋組邐ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｔＳ逡逑１邐邐邋Ｉ邋邐邋￣ｉ病毒轉(zhuǎn)染４周后取材，檢測(cè)主動(dòng)脈ｍｉＲ－１２４－３ｐ、Ｐ４ＨＡ１、ｃｏ丨丨ａｇｅｎＩ和ｃｏｌ丨ａｇｅｎＩ＾的表達(dá)；逡逑動(dòng)脈根部冰凍切片染色觀(guān)察斑塊的形態(tài)和大小，斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞＇膠原及質(zhì)的含量等，免疫組化檢測(cè)丨型及丨丨丨灥原＇邋Ｐ４ＨＡ１、ＭＭＰ２、ＭＰＰ９在斑塊內(nèi)表達(dá)情況；逡逑ＦＩＳＨ染色觀(guān)察ｍｉＲ－１２４－３ｐ在斑塊內(nèi)分布統(tǒng)計(jì)學(xué)分析逡逑圖１動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程逡逑

ＮＣ邐ｍｉＲ－１２４－３ｐ邋ｍｉｍｉｃ邋ｍｉＲ－１２４－３ｐ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑圖３邋ｍｉＲ－ｌ２４－３ｐ對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響逡逑Ａ：主動(dòng)脈大體油紅０染色；Ｂ：主動(dòng)脈根冰凍切片ＨＥ染色；Ｃ：天狼猩紅逡逑染色；Ｄ：平滑肌細(xì)胞免疫組化染色（ａ－ＳＭＡ）邋；邋Ｅ：油紅０染色；Ｆ：巨噬逡逑細(xì)胞免疫組化染色（Ｍ０ＭＡ２）。與ＮＣ組相比，，＊Ｐ＜０．０５。逡逑５
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R543.5


本文編號(hào)：2615524