【摘要】：心血管疾病(cardiovascular diseases,CVDs)已成為全球范圍內(nèi)首要死亡原因。心血管疾病成為目前疾病防治的重點之一。經(jīng)皮血管內(nèi)介入治療術(shù)是目前治療心血管疾病較為廣泛的方法之一,但隨之而來的支架植入術(shù)后再狹窄(in-stent restenosis,ISR)是介入治療術(shù)后嚴重的并發(fā)癥,是臨床面臨的挑戰(zhàn),成為又一亟待解決的難題。手術(shù)操作引起血管內(nèi)皮細胞損傷及隨之發(fā)生的血管平滑肌細胞增殖、遷移引起新生內(nèi)膜組織增生是ISR的重要環(huán)節(jié)。球囊損傷能夠模擬介入治療手術(shù)操作對血管造成的損傷,能夠在動物體內(nèi)復(fù)制介入治療所引起的病理生理學(xué)改變。另一方面,分子生物學(xué)及基因組學(xué)的飛速發(fā)展使基因治療成為可能。HGF是一種多效能生長因子,其在心血管系統(tǒng)的作用存在爭議。本研究分三部分,從超聲引導(dǎo)下球囊損傷模擬ISR建立動物模型入手,分別探討兔腹主動脈經(jīng)皮球囊損傷時不同壓力所造成的血管新生內(nèi)膜組織增生情況,HGF基因轉(zhuǎn)染兔腹主動脈后的在體表達及血管損傷對基因表達的影響,以及HGF基因轉(zhuǎn)染對兔腹主動脈血管損傷后新生內(nèi)膜形成和內(nèi)源性rHGF、c-Met表達的影響。通過本研究,為臨床解決ISR及心血管相關(guān)疾病的診斷及治療提供可靠的實驗數(shù)據(jù)。第一部分超聲引導(dǎo)下兔腹主動脈新生內(nèi)膜增生模型的建立目的:探討超聲引導(dǎo)下不同壓力球囊對血管壁損傷所引起的新生內(nèi)膜增生的影響。方法:(1)選取新西蘭大白兔20只,按照球囊擴張壓力不同分為3組:1 atm、5 atm、10 atm組,各5只,另外正常對照組5只。在全麻條件下應(yīng)用經(jīng)腹高頻超聲測量腹主動脈內(nèi)徑,按照球囊內(nèi)徑/血管內(nèi)徑=1.2選擇相應(yīng)球囊。分離右側(cè)股動脈,在超聲引導(dǎo)下將球囊送入腹主動脈,至腎動脈水平。充盈球囊,在超聲監(jiān)測下球囊完全阻斷腹主動脈血流,根據(jù)組別不同分別加壓至1 atm、5 atm、10 atm,向下回拉至髂動脈分叉處,重復(fù)操作3次,間隔30s。于球囊拉傷前、球囊拉傷術(shù)后即刻及2周時測量腹主動脈內(nèi)徑,計算術(shù)后即刻擴張率=(術(shù)后即刻內(nèi)徑-術(shù)前原始內(nèi)徑)/術(shù)前原始內(nèi)徑。(2)術(shù)后2周,取兔腹主動脈進行HE染色,觀察新生內(nèi)膜形成情況。結(jié)果:(1)二維超聲:1 atm、5 atm、10 atm組在球囊拉傷過程中球囊緊貼兔腹主動脈壁,彩色多普勒血流成像:球囊與腹主動脈壁間無血流通過。(2)球囊拉傷術(shù)后兔腹主動脈內(nèi)徑變化:1 atm、5 atm、10 atm組術(shù)后即刻腹主動脈內(nèi)徑均較術(shù)前顯著增加(P0.05),三組術(shù)后即刻擴張率無統(tǒng)計學(xué)差異。(3)球囊拉傷術(shù)后2周新生內(nèi)膜形成情況:1 atm、5 atm、10 atm組術(shù)后2周可見不同程度新生內(nèi)膜增生。5 atm和10 atm組新生內(nèi)膜周長比、面積比和內(nèi)中膜厚度比均明顯大于1 atm組(P0.05),且隨著球囊壓力增加,新生內(nèi)膜厚度明顯增加(P0.05)。結(jié)論:(1)應(yīng)用超聲進行實時引導(dǎo),能夠指導(dǎo)球囊損傷術(shù)順利進行。應(yīng)用彩色多普勒血流成像觀察球囊損傷術(shù)中血流動力學(xué)變化情況,確保所有實驗動物操作的一致性。(2)新生內(nèi)膜厚度與球囊壓力密切相關(guān)。第二部分hHGF裸質(zhì)�；蜣D(zhuǎn)染兔腹主動脈的在體表達及影響因素目的:探討不同劑量、不同時間點及不同血管狀態(tài)下hHGF轉(zhuǎn)染兔腹主動脈的在體表達情況。方法:本實驗分四部分完成:(1)根據(jù)hHGF轉(zhuǎn)染劑量不同分為4組:空質(zhì)粒組(Con),低劑量組(Low,0.02mg),中等劑量組(Medium,0.2mg),高劑量組(High,2mg),每組各3只。在轉(zhuǎn)染后第3天取兔腹主動脈,應(yīng)用RT-PCR和ELISA分別檢測兔腹主動脈hHGF mRNA和蛋白的表達。(2)根據(jù)轉(zhuǎn)染時間點不同,將實驗動物分為4組:球囊損傷術(shù)后即刻轉(zhuǎn)染組(Op0),球囊損傷術(shù)后1天轉(zhuǎn)染組(Op1),球囊拉傷術(shù)后3天轉(zhuǎn)染組(Op3),球囊損傷術(shù)后7天轉(zhuǎn)染組(Op7),每組各3只。在轉(zhuǎn)染后第3天取兔腹主動脈,應(yīng)用RT-PCR和ELISA分別檢測兔腹主動脈hHGF mRNA和蛋白的表達。(3)根據(jù)球囊損傷范圍不同,將實驗動物分為3組:正常兔腹主動脈hHGF轉(zhuǎn)染組(Nor),部分損傷(1/2)術(shù)后即刻轉(zhuǎn)染組(1/2Op),完全損傷術(shù)后即刻轉(zhuǎn)染組(Op0),各3只。在轉(zhuǎn)染后第3天取兔腹主動脈,應(yīng)用RT-PCR和ELISA分別檢測兔腹主動脈內(nèi)hHGF mRNA和蛋白的表達。(4)根據(jù)腹主動脈是否存在球囊損傷將實驗動物分為2組:正常兔腹主動脈hHGF基因轉(zhuǎn)染組(HGF)和球囊損傷術(shù)后7天基因轉(zhuǎn)染組(EI-HGF),各12只。在轉(zhuǎn)染后第3、7、14、21天時取兔腹主動脈,應(yīng)用RT-PCR和ELISA分別檢測兔腹主動脈hHGF mRNA和蛋白的表達。結(jié)果:(1)不同劑量hHGF基因轉(zhuǎn)染正常兔腹主動脈的在體表達:轉(zhuǎn)染后第3天Medium組檢測到hHGF mRNA和蛋白,Con組、Low組和High組均未檢測到hHGF mRNA和蛋白。(2)球囊損傷后不同時間點hHGF基因轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染術(shù)后第3天Op7組檢測到hHGF mRNA和蛋白。Op0組、Op1組和Op3組均未檢測到hHGF mRNA和蛋白。(3)不同損傷范圍對hHGF基因轉(zhuǎn)染的影響:1/2Op組hHGF mRNA和蛋白表達量明顯低于Nor組。Op0組未檢出hHGF mRNA和蛋白。(4)hHGF基因轉(zhuǎn)染后在體表達情況:hHGF mRNA和蛋白在體表達峰值出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后第3天,持續(xù)時間超過2周。EI-HGF組轉(zhuǎn)染后第3天hHGF mRNA的表達量低于HGF組(P0.05),EI-HGF組轉(zhuǎn)染后第3、7、14天hHGF蛋白表達量低于HGF組(P0.05)。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)球囊損傷范圍越大對基因轉(zhuǎn)染的在體表達影響越大;血管損傷降低了hHGF的在體表達;確定基因轉(zhuǎn)染最佳劑量為0.2mg,最佳轉(zhuǎn)染時間點為球囊損傷后第7天,為下一步實驗提供研究基礎(chǔ)。第三部分hHGF對球囊損傷后兔腹主動脈早期內(nèi)膜增生的影響及機制目的:探討外源性hHGF基因轉(zhuǎn)染對球囊損傷后早期新生內(nèi)膜形成的影響及其機制。方法:55只健康新西蘭大白兔,分為4組:單純球囊損傷組(EI,20只),球囊損傷+hHGF轉(zhuǎn)染組(EI-HGF,15只),球囊損傷+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(EI-V,15只),正常對照組(control,5只)。根據(jù)前兩部分實驗結(jié)果,球囊損傷的壓力設(shè)置為10 atm。hHGF基因轉(zhuǎn)染時間點為球囊損傷術(shù)后第7天,轉(zhuǎn)染劑量為0.2mg。于實驗第1、2、4、8周分別取兔腹主動脈,進行HE染色觀察兔腹主動脈新生內(nèi)膜情況,應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色觀察新生內(nèi)膜rHGF、c-Met、CD31和α-SMA表達情況,應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR檢測兔腹主動脈內(nèi)源性rHGF mRNA、c-Met、α-SMA和e NOS mRNA。結(jié)果:(1)hHGF抑制血管損傷后早期新生內(nèi)膜形成:EI組、EI-HGF組和EI-V組血管損傷術(shù)后均可見新生內(nèi)膜形成,隨著時間推移,新生內(nèi)膜明顯增厚。第2周EI-HGF組N/M比值明顯小于EI-V組(P0.001)。(2)hHGF改變新生內(nèi)膜ECs和VSMCs表達及功能:第2周EI-HGF組新生內(nèi)膜CD31陽性細胞百分比明顯高于EI-V組(P0.01)。第2周EI-HGF組兔腹主動脈e NOS mRNA表達量明顯多于EI-V組(P0.001)。第2周和第4周EI-HGF組新生內(nèi)膜單位面積α-SMA陽性細胞數(shù)明顯少于EI-V組(P0.05)。EI-HGF組兔腹主動脈α-SMA mRNA峰值后移,第2周和第4周表達量明顯低于EI-V組(第2周:P0.001;第4周:P0.01)。(3)hHGF引起內(nèi)源性rHGF和c-Met表達改變:EI-HGF組兔腹主動脈內(nèi)源性rHGF mRNA表達峰值提前,第2周和4周時,內(nèi)源性rHGF mRNA明顯高于EI-V組(第2周:P0.01;第4周:P0.05)。第2周時EI-HGF組兔腹主動脈c-Met mRNA表達量明顯高于EI-V組(P0.05)。結(jié)論:外源性給予hHGF能夠在球囊損傷術(shù)后早期顯著抑制新生內(nèi)膜增生,促進再內(nèi)皮化,改善內(nèi)皮功能,抑制平滑肌細胞增殖,其作用可能是通過增加兔腹主動脈內(nèi)源性rHGF和c-Met mRNA表達而實現(xiàn)。
【圖文】：

A B圖 2.1 兔腹主動脈解剖結(jié)構(gòu)及超聲圖像對照。圖 A：1～5 為兔腎動脈及以下水平腹主動脈的 5 個分支，，兩個白色 間為血管損傷的靶。圖 B：兔腹主動脈高頻超聲圖像： 為圖 A 中腹主動脈分支 2、3，╋為腹主動脈管壁。

CDFI）：管腔內(nèi)可見血流充填，血流信號平滑（見圖2.2 A、B）。球囊損傷術(shù)中，應(yīng)用高頻超聲實時觀察球囊位置、擴張程度及與腹主動脈關(guān)系。二維高頻超聲顯示：未充盈的球囊呈粗線狀強回聲，CDFI：球囊與血管壁間可見血流通過。二維高頻超聲顯示：充盈后的球囊呈三條細線狀強回聲，球囊前后壁緊貼于血管前后壁，CDFI：球囊充盈后，球囊與血管壁間無血流通過（見圖 2.2 C-F）。2.3.2 球囊損傷術(shù)后腹主動脈內(nèi)徑變化分別在球囊損傷術(shù)前、術(shù)后即刻及 2 周時，應(yīng)用高頻超聲測量兔腹主動脈內(nèi)徑。球囊損傷術(shù)前，1 atm、5 atm 和 10 atm 組腹主動脈內(nèi)徑比較，無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。球囊損傷術(shù)后即刻 1 atm、5 atm 和 10 atm 組腹主動脈內(nèi)徑均較術(shù)前明顯增加，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），各組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。球囊損傷術(shù)后 2 周 1 atm、5 atm 和 10 atm 組腹主動脈受血管彈性回縮影響
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R54

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本文編號：2615476