發(fā)布時(shí)間：2020-04-02 12:06

【摘要】：背景急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠心病中最危重的類型,發(fā)病后及時(shí)給予再灌注治療是治療AMI的最佳治療方法。然而,心肌血流短暫停止后再次恢復(fù)血供,會(huì)引起較單純?nèi)毖鼑?yán)重的心肌損傷,稱為心肌缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)。溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)(percutaneous coronary intervention,PCI)、冠狀動(dòng)脈旁路搭橋術(shù)(coronary artery bypass graft,CABG)和藥物基礎(chǔ)治療,是目前心梗再灌注治療主要手段。伴隨著再灌注治療手段的進(jìn)步,與之相伴的缺血再灌注損傷也引起臨床醫(yī)師愈發(fā)重視。他汀類藥物具有獨(dú)立于降脂作用外的心血管保護(hù)作用,其多效性包括抗炎、穩(wěn)定斑塊、改善內(nèi)皮功能和抑制血管平滑肌增生等,研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物后處理能夠有效保護(hù)缺血再灌注損傷。再灌注損傷補(bǔ)救激酶途徑(RISK)是后處理減輕IR損傷中重要信號(hào)通路。磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是其中重要信號(hào)分子。在再灌注初期,大量氧自由基(ROS)生成,造成線粒體損傷。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)是線粒體膜上重要的電壓依賴性離子通道,正常狀態(tài)下維持線粒體膜低通透性。當(dāng)缺血再灌注時(shí),細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化誘發(fā)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放,導(dǎo)致線粒體膜電位消失,呼吸鏈中斷,ATP耗竭,誘發(fā)細(xì)胞凋亡。而研究發(fā)現(xiàn),PI3K-Akt通路、GSK-3β、細(xì)胞內(nèi)鈣、ROS等均參與mPTP開放的調(diào)節(jié),在缺血再灌注損傷保護(hù)中發(fā)揮重要作用。目的本研究探討瑞舒伐他汀(rosuvastatin,RS)對(duì)于缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,尋找其最佳藥物濃度。并探討PI3K-Akt-GSK-3β,ROS和mPTP在其中具體作用。方法本實(shí)驗(yàn)采用Langendorff離體心臟灌流,采用結(jié)扎前降支后松開結(jié)扎線持續(xù)灌注的方法模擬心肌缺血再灌注。實(shí)驗(yàn)分為2組路線。路線1:研究不同濃度下(1-50 nmol/L)瑞舒伐他汀對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,尋找合適劑量范圍。健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為8組(每組8只,n=8):(1)I/R組(2)RS組(1nmol/L)(3)RS組(5nmol/L)(4)RS組(10nmol/L)(5)RS組(25nmol/L)(6)RS組(50nmol/L)(7)5nmol/L RS+LY294002(8)LY294002組,各組均穩(wěn)定灌注15min,缺血30min,再灌注60min。在再灌注時(shí)予瑞舒伐他汀(1nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、25nmol/L、50nmol/L)、瑞舒伐他汀聯(lián)合磷脂酰肌醇(PI3K)抑制劑LY294002,或單獨(dú)LY294002。灌流結(jié)束后,用伊文思藍(lán)和氯化三苯四唑啉(TTC)雙染色法測(cè)定心肌梗死面積。收集灌流液并檢測(cè)肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)濃度。測(cè)定各組穩(wěn)定灌流15min時(shí)、結(jié)扎前降支30min時(shí)、再灌注5、30、60min時(shí)的左室發(fā)展壓(LVDP)、左室舒張末期壓(LVEDP)、左心室內(nèi)壓力最大上升速率(dp/dt_(max))值的變化。通過上述指標(biāo)尋找瑞舒伐他汀心肌保護(hù)最佳濃度范圍。路線2:健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為5組(每組8只,n=8):(1)I/R組(2)RS組(5nmol/L)(3)5nmol/L RS+LY294002(4)LY294002組(5)假手術(shù)組。采取穩(wěn)定15min,缺血30min,再灌注10min模式。再灌注時(shí)予5nmol/L瑞舒伐他汀,瑞舒伐他汀+LY294002,或單獨(dú)LY294002。在再灌注10min后剪下左室前壁心肌組織,采用DCFH-DA方法檢測(cè)活性氧自由基(ROS)水平。檢測(cè)心肌組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA)水平。應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組左室前壁心肌PI3K-Akt-GSK-3β通路水平。分離線粒體并檢測(cè)鈣誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放水平。探討PI3K-Akt-GSK-3β通路,ROS,及mPTP在瑞舒伐探討后處理心肌保護(hù)作用中的具體機(jī)制。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單樣本KS檢驗(yàn),以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表明,組間比較用單因素方差分析,多組間的多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果(1)瑞舒伐他汀減輕再灌注損傷作用呈現(xiàn)濃度依賴性,1 nM組心肌梗死范圍與對(duì)照組無明顯差別,而5-10 nM組心肌梗死范圍較對(duì)照組明顯減少,最佳濃度為5 nM(25.69±3.75%vs 40.04±4.93%,p0.05)。隨著RS濃度增高,其對(duì)缺血再灌注損傷保護(hù)作用減退,在50nM組甚至出現(xiàn)加重趨勢(shì)(47.75±5.27%vs40.04±4.93%,p0.05)。5nM組心肌梗死范圍、LDH、CK-MB較對(duì)照組分別下降35.4%、32.9%和31.2%。5nM RS組較對(duì)照組能夠降低LVEDP,升高LVDP和dP/dtmax。RS+LY294002組、LY294002組心肌梗死范圍、LDH、CK-MB與對(duì)照組無差異(p0.05)。各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)在穩(wěn)定期和結(jié)扎期無明顯區(qū)別。RS+LY294002組、LY294002組LVDP、LVEDP、dP/dtmax與對(duì)照組無顯著差別(p0.05)。(2)RS組左室心肌p-Akt和p-GSK-3β的表達(dá)明顯高于I/R組(p0.05)。RS+LY294002組、LY294002組p-Akt和p-GSK-3β的表達(dá)與對(duì)照組相似(p0.05),LY294002能夠消除瑞舒伐他汀后處理對(duì)p-Akt和p-GSK-3β的激活,但其本身對(duì)p-Akt和p-GSK-3β激活無影響。在各組中總Akt和GSK-3β表達(dá)無差別(p0.05),在假手術(shù)組p-Akt和p-GSK-3β磷酸化未被激活。(3)I/R組MDA和ROS生成較對(duì)假手術(shù)組明顯增加,同時(shí)SOD活性下降,表明缺血再灌注時(shí)ROS活性明顯增加(p0.05)。RS后處理能夠顯著降低MDA和ROS生成,增加SOD活性(p0.05)。LY294002能夠消除瑞舒伐他汀后處理對(duì)ROS的抑制作用,同時(shí)其本身對(duì)ROS活性無影響。(4)在假手術(shù)組,平均誘導(dǎo)mPTP開放的鈣離子濃度為123±26μmol Ca~(2+)/mg。在I/R組中,誘導(dǎo)mPTP開放的鈣離子濃度降至32±10μmol Ca~(2+)/mg(p0.05 vs sham組),表明在缺血再灌注激活mPTP開放。瑞舒伐他汀后處理增加誘導(dǎo)mPTP開放的鈣離子濃度至90±18μmol Ca~(2+)/mg(p0.05 vs I/R組),表明瑞舒伐他汀后處理抑制mPTP開放。但瑞舒伐他汀本身對(duì)于mPTP開放無明顯影響(117±24vs 123±26μmol Ca~(2+)/mg,p0.05)。同時(shí),LY294002能夠消除瑞舒伐他汀后處理對(duì)mPTP開放的抑制作用(41±9 vs 90±18μmol Ca~(2+)/mg,p0.05)。表明瑞舒伐他汀后處理通過激活PI3K-Akt通路,抑制mPTP開放產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。結(jié)論(1)瑞舒伐他汀降低再灌注損傷呈現(xiàn)濃度依賴性。在5 nM時(shí),瑞舒伐他汀后處理可以有效減少再灌注時(shí)心肌梗死面積,改善再灌注時(shí)血流動(dòng)力學(xué),有心肌保護(hù)作用。隨著RS濃度增高,其對(duì)缺血再灌注損傷保護(hù)作用減退,在50nM組甚至出現(xiàn)心肌損害趨勢(shì)。(2)瑞舒伐他汀后處理通過激活PI3K-Akt-GSK-3β通路,產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。(3)瑞舒伐他汀后處理抑制ROS生成,產(chǎn)生心肌保護(hù)作用,且對(duì)ROS的抑制作用是PI3K-Akt-GSK-3β通路依賴性的。(4)瑞舒伐他汀后處理抑制mPTP開放。mPTP作為PI3K-Akt-GSK-3β通路和ROS系統(tǒng)的終末效應(yīng)器,在瑞舒伐他汀后處理心肌保護(hù)作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
【圖文】：

圖1：后處理心肌保護(hù)中的信號(hào)通路。引用自文獻(xiàn)[38]。細(xì)胞外的腺苷，緩激肽，阿片類藥物等信號(hào)分子結(jié)合至細(xì)胞膜上相應(yīng)受體后激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路:PI3K-Akt通路，p42/p44 ERKs通路，SAFE通路，隨后進(jìn)一步活化信號(hào)瀑布中下游信號(hào)分子：NO, GSK-3 ,PKC,線粒體KATP通路，最終作用于線粒體mPTP，抑制其開放，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。他汀類藥物是目前臨床上廣泛應(yīng)用的調(diào)脂藥，在冠狀動(dòng)脈性心臟病(coronaryartery disease，CAD )的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防[39]中發(fā)揮著非常重要的作用。在實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)表明他汀類藥物具有獨(dú)立于降脂作用外的心血管保護(hù)作用，，其多效性包括抗炎、穩(wěn)定斑塊、改善內(nèi)皮功能和抑制血管平滑肌增生等[40]。臨床研究(ARMYDA-ACS實(shí)驗(yàn))[41]發(fā)現(xiàn)非ST段抬高的ACS患者在進(jìn)行PCI前使用阿托伐伐他汀能夠顯著減少30天內(nèi)心臟不良事件的發(fā)生（阿托伐伐他汀組發(fā)生心肌梗死5%，對(duì)照組15%）。而研究表明，瑞舒伐他汀的降脂作用較傳統(tǒng)的阿托伐他汀等藥物更加強(qiáng)大，血脂達(dá)標(biāo)率更高，因而其心肌保護(hù)作用亦引發(fā)研究熱情。Yun等[42]在ACS患者行PCI術(shù)后給予40mg瑞舒伐他汀，研究發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀組

各組染色結(jié)果見圖 1-4，非缺血區(qū)被伊文思藍(lán)染成藍(lán)色，缺血區(qū)未被藍(lán)染。各組缺血區(qū)面積類似，表明各組結(jié)扎前降支供血范圍基本相同。缺血區(qū)包含括梗死區(qū)和非梗死區(qū)：非梗死區(qū)為磚紅色，梗死區(qū)為灰白色。RS 組 MI 范圍為40.04±4.93%。RS 后處理對(duì)心肌梗死面積影響呈現(xiàn)濃度依賴性。1 nM 組心肌梗死范圍與對(duì)照組無明顯差別，而 RS 組(5-10 nM )較對(duì)照組明顯減少，最佳濃度于 5 nM（25.69±3.75% vs 40.04±4.93%, p < 0.05 表 1-2）。隨著 RS 濃度增高，其對(duì)缺血再灌注損傷保護(hù)作用減退，在 50nM 組甚至出現(xiàn)加重趨勢(shì)(47.75±5.27%vs 40.04±4.93%, p < 0.05)。RS+ LY294002 組心肌梗死范圍與對(duì)照組相似（38.76%±4.13 vs 40.04±4.93%, p>0.05）。LY294002 組心肌梗死范圍與對(duì)照組無明顯差別（41.67%±4.82 vs 40.04±4.93%, p>0.05）。LY294002 能夠消除瑞舒伐他汀后處理的對(duì)于減少心肌梗塞面積的保護(hù)作用（p<0.05），且其本身并未影響缺血再灌注損傷時(shí)心肌梗塞面積，表明瑞舒伐他汀后處理激活 PI3K-Akt 通路發(fā)揮心肌保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R542.22

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本文編號(hào)：2611931