【摘要】：背景急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠心病中最危重的類型,發(fā)病后及時給予再灌注治療是治療AMI的最佳治療方法。然而,心肌血流短暫停止后再次恢復血供,會引起較單純?nèi)毖鼑乐氐男募p傷,稱為心肌缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)。溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(percutaneous coronary intervention,PCI)、冠狀動脈旁路搭橋術(coronary artery bypass graft,CABG)和藥物基礎治療,是目前心梗再灌注治療主要手段。伴隨著再灌注治療手段的進步,與之相伴的缺血再灌注損傷也引起臨床醫(yī)師愈發(fā)重視。他汀類藥物具有獨立于降脂作用外的心血管保護作用,其多效性包括抗炎、穩(wěn)定斑塊、改善內(nèi)皮功能和抑制血管平滑肌增生等,研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物后處理能夠有效保護缺血再灌注損傷。再灌注損傷補救激酶途徑(RISK)是后處理減輕IR損傷中重要信號通路。磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是其中重要信號分子。在再灌注初期,大量氧自由基(ROS)生成,造成線粒體損傷。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)是線粒體膜上重要的電壓依賴性離子通道,正常狀態(tài)下維持線粒體膜低通透性。當缺血再灌注時,細胞內(nèi)環(huán)境變化誘發(fā)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放,導致線粒體膜電位消失,呼吸鏈中斷,ATP耗竭,誘發(fā)細胞凋亡。而研究發(fā)現(xiàn),PI3K-Akt通路、GSK-3β、細胞內(nèi)鈣、ROS等均參與mPTP開放的調(diào)節(jié),在缺血再灌注損傷保護中發(fā)揮重要作用。目的本研究探討瑞舒伐他汀(rosuvastatin,RS)對于缺血再灌注損傷的保護作用,尋找其最佳藥物濃度。并探討PI3K-Akt-GSK-3β,ROS和mPTP在其中具體作用。方法本實驗采用Langendorff離體心臟灌流,采用結扎前降支后松開結扎線持續(xù)灌注的方法模擬心肌缺血再灌注。實驗分為2組路線。路線1:研究不同濃度下(1-50 nmol/L)瑞舒伐他汀對缺血再灌注損傷的保護作用,尋找合適劑量范圍。健康雄性Wistar大鼠隨機分為8組(每組8只,n=8):(1)I/R組(2)RS組(1nmol/L)(3)RS組(5nmol/L)(4)RS組(10nmol/L)(5)RS組(25nmol/L)(6)RS組(50nmol/L)(7)5nmol/L RS+LY294002(8)LY294002組,各組均穩(wěn)定灌注15min,缺血30min,再灌注60min。在再灌注時予瑞舒伐他汀(1nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、25nmol/L、50nmol/L)、瑞舒伐他汀聯(lián)合磷脂酰肌醇(PI3K)抑制劑LY294002,或單獨LY294002。灌流結束后,用伊文思藍和氯化三苯四唑啉(TTC)雙染色法測定心肌梗死面積。收集灌流液并檢測肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)濃度。測定各組穩(wěn)定灌流15min時、結扎前降支30min時、再灌注5、30、60min時的左室發(fā)展壓(LVDP)、左室舒張末期壓(LVEDP)、左心室內(nèi)壓力最大上升速率(dp/dt_(max))值的變化。通過上述指標尋找瑞舒伐他汀心肌保護最佳濃度范圍。路線2:健康雄性Wistar大鼠隨機分為5組(每組8只,n=8):(1)I/R組(2)RS組(5nmol/L)(3)5nmol/L RS+LY294002(4)LY294002組(5)假手術組。采取穩(wěn)定15min,缺血30min,再灌注10min模式。再灌注時予5nmol/L瑞舒伐他汀,瑞舒伐他汀+LY294002,或單獨LY294002。在再灌注10min后剪下左室前壁心肌組織,采用DCFH-DA方法檢測活性氧自由基(ROS)水平。檢測心肌組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA)水平。應用Western blot檢測各組左室前壁心肌PI3K-Akt-GSK-3β通路水平。分離線粒體并檢測鈣誘導線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放水平。探討PI3K-Akt-GSK-3β通路,ROS,及mPTP在瑞舒伐探討后處理心肌保護作用中的具體機制。實驗數(shù)據(jù)進行單樣本KS檢驗,以均數(shù)±標準差表明,組間比較用單因素方差分析,多組間的多重比較采用SNK-q檢驗。p0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果(1)瑞舒伐他汀減輕再灌注損傷作用呈現(xiàn)濃度依賴性,1 nM組心肌梗死范圍與對照組無明顯差別,而5-10 nM組心肌梗死范圍較對照組明顯減少,最佳濃度為5 nM(25.69±3.75%vs 40.04±4.93%,p0.05)。隨著RS濃度增高,其對缺血再灌注損傷保護作用減退,在50nM組甚至出現(xiàn)加重趨勢(47.75±5.27%vs40.04±4.93%,p0.05)。5nM組心肌梗死范圍、LDH、CK-MB較對照組分別下降35.4%、32.9%和31.2%。5nM RS組較對照組能夠降低LVEDP,升高LVDP和dP/dtmax。RS+LY294002組、LY294002組心肌梗死范圍、LDH、CK-MB與對照組無差異(p0.05)。各組血流動力學指標在穩(wěn)定期和結扎期無明顯區(qū)別。RS+LY294002組、LY294002組LVDP、LVEDP、dP/dtmax與對照組無顯著差別(p0.05)。(2)RS組左室心肌p-Akt和p-GSK-3β的表達明顯高于I/R組(p0.05)。RS+LY294002組、LY294002組p-Akt和p-GSK-3β的表達與對照組相似(p0.05),LY294002能夠消除瑞舒伐他汀后處理對p-Akt和p-GSK-3β的激活,但其本身對p-Akt和p-GSK-3β激活無影響。在各組中總Akt和GSK-3β表達無差別(p0.05),在假手術組p-Akt和p-GSK-3β磷酸化未被激活。(3)I/R組MDA和ROS生成較對假手術組明顯增加,同時SOD活性下降,表明缺血再灌注時ROS活性明顯增加(p0.05)。RS后處理能夠顯著降低MDA和ROS生成,增加SOD活性(p0.05)。LY294002能夠消除瑞舒伐他汀后處理對ROS的抑制作用,同時其本身對ROS活性無影響。(4)在假手術組,平均誘導mPTP開放的鈣離子濃度為123±26μmol Ca~(2+)/mg。在I/R組中,誘導mPTP開放的鈣離子濃度降至32±10μmol Ca~(2+)/mg(p0.05 vs sham組),表明在缺血再灌注激活mPTP開放。瑞舒伐他汀后處理增加誘導mPTP開放的鈣離子濃度至90±18μmol Ca~(2+)/mg(p0.05 vs I/R組),表明瑞舒伐他汀后處理抑制mPTP開放。但瑞舒伐他汀本身對于mPTP開放無明顯影響(117±24vs 123±26μmol Ca~(2+)/mg,p0.05)。同時,LY294002能夠消除瑞舒伐他汀后處理對mPTP開放的抑制作用(41±9 vs 90±18μmol Ca~(2+)/mg,p0.05)。表明瑞舒伐他汀后處理通過激活PI3K-Akt通路,抑制mPTP開放產(chǎn)生心肌保護作用。結論(1)瑞舒伐他汀降低再灌注損傷呈現(xiàn)濃度依賴性。在5 nM時,瑞舒伐他汀后處理可以有效減少再灌注時心肌梗死面積,改善再灌注時血流動力學,有心肌保護作用。隨著RS濃度增高,其對缺血再灌注損傷保護作用減退,在50nM組甚至出現(xiàn)心肌損害趨勢。(2)瑞舒伐他汀后處理通過激活PI3K-Akt-GSK-3β通路,產(chǎn)生心肌保護作用。(3)瑞舒伐他汀后處理抑制ROS生成,產(chǎn)生心肌保護作用,且對ROS的抑制作用是PI3K-Akt-GSK-3β通路依賴性的。(4)瑞舒伐他汀后處理抑制mPTP開放。mPTP作為PI3K-Akt-GSK-3β通路和ROS系統(tǒng)的終末效應器,在瑞舒伐他汀后處理心肌保護作用中發(fā)揮關鍵作用。
【圖文】：

圖1：后處理心肌保護中的信號通路。引用自文獻[38]。細胞外的腺苷，緩激肽，阿片類藥物等信號分子結合至細胞膜上相應受體后激活細胞內(nèi)信號通路:PI3K-Akt通路，p42/p44 ERKs通路，SAFE通路，隨后進一步活化信號瀑布中下游信號分子：NO, GSK-3 ,PKC,線粒體KATP通路，最終作用于線粒體mPTP，抑制其開放，發(fā)揮心肌保護作用。他汀類藥物是目前臨床上廣泛應用的調(diào)脂藥，在冠狀動脈性心臟病(coronaryartery disease，CAD )的一級和二級預防[39]中發(fā)揮著非常重要的作用。在實驗研究已經(jīng)表明他汀類藥物具有獨立于降脂作用外的心血管保護作用，，其多效性包括抗炎、穩(wěn)定斑塊、改善內(nèi)皮功能和抑制血管平滑肌增生等[40]。臨床研究(ARMYDA-ACS實驗)[41]發(fā)現(xiàn)非ST段抬高的ACS患者在進行PCI前使用阿托伐伐他汀能夠顯著減少30天內(nèi)心臟不良事件的發(fā)生（阿托伐伐他汀組發(fā)生心肌梗死5%，對照組15%）。而研究表明，瑞舒伐他汀的降脂作用較傳統(tǒng)的阿托伐他汀等藥物更加強大，血脂達標率更高，因而其心肌保護作用亦引發(fā)研究熱情。Yun等[42]在ACS患者行PCI術后給予40mg瑞舒伐他汀，研究發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀組

各組染色結果見圖 1-4，非缺血區(qū)被伊文思藍染成藍色，缺血區(qū)未被藍染。各組缺血區(qū)面積類似，表明各組結扎前降支供血范圍基本相同。缺血區(qū)包含括梗死區(qū)和非梗死區(qū)：非梗死區(qū)為磚紅色，梗死區(qū)為灰白色。RS 組 MI 范圍為40.04±4.93%。RS 后處理對心肌梗死面積影響呈現(xiàn)濃度依賴性。1 nM 組心肌梗死范圍與對照組無明顯差別，而 RS 組(5-10 nM )較對照組明顯減少，最佳濃度于 5 nM（25.69±3.75% vs 40.04±4.93%, p < 0.05 表 1-2）。隨著 RS 濃度增高，其對缺血再灌注損傷保護作用減退，在 50nM 組甚至出現(xiàn)加重趨勢(47.75±5.27%vs 40.04±4.93%, p < 0.05)。RS+ LY294002 組心肌梗死范圍與對照組相似（38.76%±4.13 vs 40.04±4.93%, p>0.05）。LY294002 組心肌梗死范圍與對照組無明顯差別（41.67%±4.82 vs 40.04±4.93%, p>0.05）。LY294002 能夠消除瑞舒伐他汀后處理的對于減少心肌梗塞面積的保護作用（p<0.05），且其本身并未影響缺血再灌注損傷時心肌梗塞面積，表明瑞舒伐他汀后處理激活 PI3K-Akt 通路發(fā)揮心肌保護作用。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R542.22

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本文編號：2611931