【摘要】：研究背景心血管疾病尤其是急性心肌梗死造成的心源性死亡已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)最主要的死亡原因之一。由于心肌細胞缺乏再生能力,壞死的心肌被纖維瘢痕組織所取代,導致心肌梗死后的心臟發(fā)生重構及心室機械功能障礙,最終發(fā)展為心力衰竭。因此,如何使梗死區(qū)域的心肌細胞數(shù)量及功能得到改善,從根本上修復已壞死的心肌組織,是缺血性心臟病治療中所面臨的關鍵問題。近幾年研究已成功將人誘導性多能干細胞(human induced pluripotent stem cells,hi PSCs)分化為心肌樣細胞,為心肌梗死的細胞治療研究提供了巨大動力,是缺血性心臟病干細胞移植治療的潛在細胞來源。然而,目前由誘導性多能干細胞得到的心肌樣細胞(induced pluripotent stem cell-Cardiomyocytes,i PSC-CMs)與成人心肌細胞相比相對不成熟,成熟的心肌樣細胞才能更好地體現(xiàn)人類心肌細胞的生理機能,建立更有效的疾病模型和藥物篩選體系,取得更佳的細胞移植治療效果并降低心律失常發(fā)生的風險。甲狀腺激T3對正常心肌的發(fā)育至關重要,能從多方面誘導并促進心肌細胞的成熟。目前有關甲狀腺激素T3用于促進人誘導性多功能干細胞源性心肌樣細胞(human induced pluripotent stem cell-Cardiomyocytes,hi PSC-CMs)成熟性的相關研究較少,且尚無甲狀腺激T3在誘導分化期第0天至第7天促進hi PSC-CMs成熟的相關研究報道。研究目的采用三碘甲狀腺素原氨酸(T3)對人誘導性多能干細胞(hi PSC)進行誘導,探討其在心肌樣細胞分化過程中促進hi PSC-CMs成熟的可行性。研究方法(1)抽取健康成人靜脈血,利用密度梯度離心法分離培養(yǎng)外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs),采用仙臺病毒載體將外源性轉錄因子導入PBMCs,建立人誘導性多能干細胞系;通過形態(tài)學觀察,堿性磷酸酶活細胞染色、免疫熒光染色,擬胚體形成等方法對hi PSCs進行鑒定;并通過核型鑒定,檢測hi PSCs是否發(fā)生突變。(2)利用化學既定方法誘導hi PSCs分為心肌樣細胞;通過觀察其形態(tài)學變化,以及Nkx2.5、c Tn T和MLC2v的免疫熒光表達情況,對得到的心肌樣細胞進行鑒定。(3)在hi PSCs向心肌細胞誘導分化期間,用甲狀腺激素T3進行藥物干預。并于藥物干預的第7天檢測T3組與對照組Nkx2.5、c Tn T、MLC2v等指標的免疫熒光表達情況,行流式細胞學檢測細胞周期、線粒體數(shù)量變化,通過透射電鏡觀察細胞內(nèi)超微結構的差別。研究結果(1)外源性轉錄因子導入PBMCs后第14天獲得典型誘導性多能干細胞克隆;堿性磷酸酶活細胞染色表達強陽性;免疫熒光染色檢測顯示:OCT3/4、TRA-1-60、TRA-1-81、Nanog、SOX2、SSEA-4等人誘導性多能干細胞特有標記物表達陽性;hi PSCs經(jīng)懸浮培養(yǎng)形成擬胚體。hi PSCs染色體未出現(xiàn)異常的缺失、擴增或移位。(2)hi PSCs分化得到心肌樣細胞,細胞形態(tài)由克隆集落逐漸變?yōu)槎噙呅位蛩笮?心肌特有標志物Nkx2.5、c Tn T和MLC2v等免疫熒光表達陽性。(3)甲狀腺激素T3組心肌樣細胞的Nkx2.5、c Tn T和MLC2v等指標的免疫熒光表達水平與對照組無明顯差異;流式細胞學檢測T3組細胞周期G1/G0期增多,細胞增殖能力減弱;T3組線粒體數(shù)量明顯增多;透射電鏡顯示T3組心肌樣細胞與對照組相比糖原、線粒體增多,細胞內(nèi)出現(xiàn)少量早期肌原纖維,部分細胞之間含有閏盤結構和細胞間緊密連接,其結構較對照組更接近成熟的心肌細胞。結論本實驗研究結果表明,可利用仙臺病毒系統(tǒng)將外源性轉錄因子導入PMBCs得到穩(wěn)定增殖的hi PSCs;并可將hi PSCs誘導分化為足量的心肌樣細胞用于進一步研究;且甲狀腺激素T3在誘導分化期間可促進心肌樣細胞的成熟。
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2.15 統(tǒng)計學處理計量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計采用專業(yè)統(tǒng)計軟件 SPSS 19.0，以 x ±s 表示，組間均數(shù)較采用方差分析，兩組比較采用 t 檢驗，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計意義。3、結果3.1 仙臺病毒感染 PBMCs 得到 iPSCs在無滋養(yǎng)層條件下，仙臺病毒感染 PBMCs 后約第 12 天左右，，培養(yǎng)皿中始出現(xiàn)較為松散的 iPSC（s經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)1x105個細胞/孔形成的克隆最好最多）并呈集落生長，在第 14 天左右，集落生長較致密，邊緣清晰，集落內(nèi)細胞排緊密，細胞核質(zhì)比高，在轉染后的第 20 天左右，克隆生長到肉眼可見的大小使用 0.5mM EDTA 溶液消化挑選克隆，傳代至玻連蛋白包被的培養(yǎng)皿中，繼貼壁生長。

圖 3-2 凍存復蘇 4 天后形成大個 hiPSCs 集落A：40x；B：100x。3.3 堿性磷酸酶活性染色堿性磷酸酶是多能性干細胞的一種表型標記物，在大多數(shù)細胞類型中均有表達，但其在多能性干細胞中表達水平明顯升高。使用堿性磷酸酶活性染料染色hiPSCs，其結果顯示 hiPSCs 堿性磷酸酶表達強陽性。
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R54

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 朱峰;翁國星;;提高移植細胞在心肌梗死區(qū)域存活率的研究進展[J];中華胸心血管外科雜志;2017年09期

2 黃楓,余志斌,高峰;心肌肌原纖維的分子結構與功能[J];心臟雜志;2000年01期

3 徐芳;鄒朝春;;甲狀腺功能減低對心臟的影響[J];浙江醫(yī)學;2011年12期

本文編號：2610314