【摘要】：研究背景心血管疾病尤其是急性心肌梗死造成的心源性死亡已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)最主要的死亡原因之一。由于心肌細(xì)胞缺乏再生能力,壞死的心肌被纖維瘢痕組織所取代,導(dǎo)致心肌梗死后的心臟發(fā)生重構(gòu)及心室機(jī)械功能障礙,最終發(fā)展為心力衰竭。因此,如何使梗死區(qū)域的心肌細(xì)胞數(shù)量及功能得到改善,從根本上修復(fù)已壞死的心肌組織,是缺血性心臟病治療中所面臨的關(guān)鍵問題。近幾年研究已成功將人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells,hi PSCs)分化為心肌樣細(xì)胞,為心肌梗死的細(xì)胞治療研究提供了巨大動(dòng)力,是缺血性心臟病干細(xì)胞移植治療的潛在細(xì)胞來源。然而,目前由誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞得到的心肌樣細(xì)胞(induced pluripotent stem cell-Cardiomyocytes,i PSC-CMs)與成人心肌細(xì)胞相比相對不成熟,成熟的心肌樣細(xì)胞才能更好地體現(xiàn)人類心肌細(xì)胞的生理機(jī)能,建立更有效的疾病模型和藥物篩選體系,取得更佳的細(xì)胞移植治療效果并降低心律失常發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。甲狀腺激T3對正常心肌的發(fā)育至關(guān)重要,能從多方面誘導(dǎo)并促進(jìn)心肌細(xì)胞的成熟。目前有關(guān)甲狀腺激素T3用于促進(jìn)人誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞源性心肌樣細(xì)胞(human induced pluripotent stem cell-Cardiomyocytes,hi PSC-CMs)成熟性的相關(guān)研究較少,且尚無甲狀腺激T3在誘導(dǎo)分化期第0天至第7天促進(jìn)hi PSC-CMs成熟的相關(guān)研究報(bào)道。研究目的采用三碘甲狀腺素原氨酸(T3)對人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(hi PSC)進(jìn)行誘導(dǎo),探討其在心肌樣細(xì)胞分化過程中促進(jìn)hi PSC-CMs成熟的可行性。研究方法(1)抽取健康成人靜脈血,利用密度梯度離心法分離培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs),采用仙臺(tái)病毒載體將外源性轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入PBMCs,建立人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞系;通過形態(tài)學(xué)觀察,堿性磷酸酶活細(xì)胞染色、免疫熒光染色,擬胚體形成等方法對hi PSCs進(jìn)行鑒定;并通過核型鑒定,檢測hi PSCs是否發(fā)生突變。(2)利用化學(xué)既定方法誘導(dǎo)hi PSCs分為心肌樣細(xì)胞;通過觀察其形態(tài)學(xué)變化,以及Nkx2.5、c Tn T和MLC2v的免疫熒光表達(dá)情況,對得到的心肌樣細(xì)胞進(jìn)行鑒定。(3)在hi PSCs向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化期間,用甲狀腺激素T3進(jìn)行藥物干預(yù)。并于藥物干預(yù)的第7天檢測T3組與對照組Nkx2.5、c Tn T、MLC2v等指標(biāo)的免疫熒光表達(dá)情況,行流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞周期、線粒體數(shù)量變化,通過透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的差別。研究結(jié)果(1)外源性轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入PBMCs后第14天獲得典型誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞克隆;堿性磷酸酶活細(xì)胞染色表達(dá)強(qiáng)陽性;免疫熒光染色檢測顯示:OCT3/4、TRA-1-60、TRA-1-81、Nanog、SOX2、SSEA-4等人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞特有標(biāo)記物表達(dá)陽性;hi PSCs經(jīng)懸浮培養(yǎng)形成擬胚體。hi PSCs染色體未出現(xiàn)異常的缺失、擴(kuò)增或移位。(2)hi PSCs分化得到心肌樣細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)由克隆集落逐漸變?yōu)槎噙呅位蛩笮?心肌特有標(biāo)志物Nkx2.5、c Tn T和MLC2v等免疫熒光表達(dá)陽性。(3)甲狀腺激素T3組心肌樣細(xì)胞的Nkx2.5、c Tn T和MLC2v等指標(biāo)的免疫熒光表達(dá)水平與對照組無明顯差異;流式細(xì)胞學(xué)檢測T3組細(xì)胞周期G1/G0期增多,細(xì)胞增殖能力減弱;T3組線粒體數(shù)量明顯增多;透射電鏡顯示T3組心肌樣細(xì)胞與對照組相比糖原、線粒體增多,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)少量早期肌原纖維,部分細(xì)胞之間含有閏盤結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間緊密連接,其結(jié)構(gòu)較對照組更接近成熟的心肌細(xì)胞。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,可利用仙臺(tái)病毒系統(tǒng)將外源性轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入PMBCs得到穩(wěn)定增殖的hi PSCs;并可將hi PSCs誘導(dǎo)分化為足量的心肌樣細(xì)胞用于進(jìn)一步研究;且甲狀腺激素T3在誘導(dǎo)分化期間可促進(jìn)心肌樣細(xì)胞的成熟。
【圖文】：

2.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)采用專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 19.0，以 x ±s 表示，組間均數(shù)較采用方差分析，兩組比較采用 t 檢驗(yàn)，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)意義。3、結(jié)果3.1 仙臺(tái)病毒感染 PBMCs 得到 iPSCs在無滋養(yǎng)層條件下，仙臺(tái)病毒感染 PBMCs 后約第 12 天左右，，培養(yǎng)皿中始出現(xiàn)較為松散的 iPSC（s經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)1x105個(gè)細(xì)胞/孔形成的克隆最好最多）并呈集落生長，在第 14 天左右，集落生長較致密，邊緣清晰，集落內(nèi)細(xì)胞排緊密，細(xì)胞核質(zhì)比高，在轉(zhuǎn)染后的第 20 天左右，克隆生長到肉眼可見的大小使用 0.5mM EDTA 溶液消化挑選克隆，傳代至玻連蛋白包被的培養(yǎng)皿中，繼貼壁生長。

圖 3-2 凍存復(fù)蘇 4 天后形成大個(gè) hiPSCs 集落A：40x；B：100x。3.3 堿性磷酸酶活性染色堿性磷酸酶是多能性干細(xì)胞的一種表型標(biāo)記物，在大多數(shù)細(xì)胞類型中均有表達(dá)，但其在多能性干細(xì)胞中表達(dá)水平明顯升高。使用堿性磷酸酶活性染料染色hiPSCs，其結(jié)果顯示 hiPSCs 堿性磷酸酶表達(dá)強(qiáng)陽性。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R54

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 朱峰;翁國星;;提高移植細(xì)胞在心肌梗死區(qū)域存活率的研究進(jìn)展[J];中華胸心血管外科雜志;2017年09期

2 黃楓,余志斌,高峰;心肌肌原纖維的分子結(jié)構(gòu)與功能[J];心臟雜志;2000年01期

3 徐芳;鄒朝春;;甲狀腺功能減低對心臟的影響[J];浙江醫(yī)學(xué);2011年12期

本文編號(hào)：2610314