【摘要】：心血管疾病是威脅人類健康的第一大疾病,全球每年有730萬人死于缺血性心臟病,列各病之首。冠狀動脈旁路移植術、血液透析或外周血管閉塞治療等使小口徑TEBV(TEBVs6mm)的臨床需求日益增大。但目前還未見小口徑TEBV應用于臨床產(chǎn)品的報道,究其原因主要是因為小口徑TEBV移植后容易發(fā)生5方面問題:急性血栓形成、吻合口內(nèi)膜增生、動脈瘤形成、感染、動脈粥樣硬化進展和鈣化;因此構建保持長期通暢小口徑TEBV仍是領域內(nèi)難題和全球性挑戰(zhàn)。小口徑TEBV在植入體內(nèi)后引發(fā)的急慢性炎癥反應是引起小口徑TEBV血栓和內(nèi)膜增生的重要誘因,目前公認的解決辦法是促進TEBV的早期內(nèi)皮化。內(nèi)皮祖細胞(EPCs)作為促進TEBV實現(xiàn)在體內(nèi)皮化的靶細胞,誘導其歸巢并分化為內(nèi)皮細胞是小口徑TEBV在體構建的策略。研究表明急性炎癥反應可以促進組織再生發(fā)生和骨髓EPC的動員,而炎癥的及時消退對歸巢干細胞的存活又十分必要,因此及時促進炎癥消退對TEBV在體內(nèi)皮化和保持長期通暢可能有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)軸突導向因子1(netrin-1)在天然血管的內(nèi)皮細胞中有表達,其可作用于UNC5B和DCC受體促進血管生成,并具有抗炎作用。本研究采用層層自組裝的方式構建殼聚糖納米顆粒包裹netrin-1修飾的小口徑TEBV,通過大量體內(nèi)和體外實驗研究其在調控巨噬細胞(MΦ)表型轉化和小口徑TEBV炎癥消退及內(nèi)皮化中的作用和機制。本研究構建的netrin-1修飾小口徑TEBV植入后及時促炎癥消退并順利完成內(nèi)皮化,最終在正常大鼠體內(nèi)可保持14個月的通暢。但是在植入糖尿病大鼠后,由于機體脂質代謝紊亂,動脈粥樣硬化易發(fā),TEBV發(fā)生鈣化的比例卻極高,直接影響移植血管的通暢和功能。小口徑TEBV移植是治療糖尿病中小血管病變的重要手段,因此,如何在高糖下防止TEBV鈣化、促進遠期通暢,是TEBV移植治療糖尿病血管病變需解決的關鍵問題。自體環(huán)境中人體除毛細血管外幾乎所有血管都受交感縮血管纖維的神經(jīng)支配,我們前期研究發(fā)現(xiàn)TEBV神經(jīng)長入與平滑肌正常重建呈正相關,但其機制尚不清楚,所以深入研究神經(jīng)重建對于小口徑TEBV的作用具有重要意義。因此,圍繞上述科學問題,我們從四個方面深入研究炎癥消退和神經(jīng)重建在構建抗血栓和抗高糖鈣化的可保持長期通暢的TEBV中的重要作用:一、netrin-1調控小口徑TEBV炎癥消退及其機制研究本實驗通過層層自主裝方式將netrin-1包裹于殼聚糖納米顆粒中并交聯(lián)于TEBV表面,使TEBV具有良好的力學強度和長時間穩(wěn)定緩釋功能分子的能力以解決炎癥和血栓形成問題。在體外通過流式、免疫熒光等方式檢測了netrin-1對MΦ表型轉化的作用,并進一步檢測其上清炎癥因子來驗證轉化效率,體內(nèi)通過免疫熒光方式檢測TEBV原位MΦ的浸潤以及netrin-1對于炎癥消退的作用。結果發(fā)現(xiàn)netrin-1可作用于A2b受體激活MΦ內(nèi)PPARγ信號通路從而將其重編程為強表達CD163的抗炎型。在將netrin-1修飾的TEBV移植入大鼠體內(nèi)后,發(fā)現(xiàn)netrin-1可促進在血管植入后3-7 d時原位浸潤的MΦ轉化為抗炎型,之后在14 d時已流出內(nèi)膜表面,從而實現(xiàn)小口徑TEBV的早期炎癥消退,為歸巢入的干細胞提供良好的再生微環(huán)境。二、炎癥消退對小口徑TEBV內(nèi)皮化意義及其機制研究本部分我們研究在炎癥消退中起關鍵作用的MΦ對EPCs增殖,遷移和血管生成能力的影響。此基礎上在大鼠體內(nèi)研究了小口徑TEBV炎癥消退和內(nèi)皮化關系并探究其作用機制。首先,通過大量對比研究實驗找到了提取MΦ外泌體時間、經(jīng)濟成本低且獲得純度高的超高速離心結合蔗糖墊方法,之后提取了不同表型MΦ的外泌體與EPCs共培養(yǎng),觀察其對EPCs功能的影響。結果發(fā)現(xiàn)促炎型MΦ外泌體可促進EPCs遷移,但長期存在不利于其增殖,而抗炎型MΦ外泌體則可明顯提升EPCs的增殖和基質膠成管能力。Netrin-1修飾的小口徑TEBV在植入體內(nèi)后發(fā)現(xiàn),其內(nèi)皮化進程與炎癥消退息息相關,炎癥消退組的TEBV在30 d時完成早期內(nèi)皮化并保持較長時間通暢,證實了及時促進TEBV炎癥消退是其實現(xiàn)早期內(nèi)皮化的必要條件。在臨床血管移植中,炎癥總是血栓形成和阻塞血管移植物的重要誘因,本研究將為血管移植物在宿主中的長期存活提供新的視角,也可能為其他炎癥性疾病提供有效治療方法。三、糖尿病下神經(jīng)元外泌體對血管平滑肌細胞鈣化作用及其機制研究本部分研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)外泌體對抑制高糖條件下血管平滑肌細胞(SMC)表型轉化和氧化應激具有顯著作用,進一步對神經(jīng)外泌體做質譜分析,發(fā)現(xiàn)其中含有大量的抑制氧化應激蛋白prdx-1。電鏡和BCA蛋白濃度測定發(fā)現(xiàn)高糖狀態(tài)下神經(jīng)分泌外泌體的數(shù)量銳減,免疫熒光結果顯示是這是由于負責囊泡運輸?shù)腞ab35激活受到抑制。本研究通過外源性遞送DENND1A,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元內(nèi)Rab35被激活,外泌體分泌功能增強恢復。之后,進一步研究了神經(jīng)元外泌體對SMC作用,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元外泌體可抑制高糖時SMC內(nèi)的活性氧(ROS)含量升高和蛋白損傷,而其機制可能是因為外泌體可抑制高糖時SMC內(nèi)線粒體膜通道過度開放和膜電位升高。在SMC培養(yǎng)上清加入神經(jīng)元外泌體后,高糖所誘導的細胞異常增殖、遷移以及鈣化均明顯受到抑制,抑制劑組結果證實外泌體的這一作用很可能是通過prdx-1抑制SMC氧化應激實現(xiàn)的。本研究發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)細胞對VSMC維持正常表型的重要意義及作用機制,為臨床預防和治療糖尿病血管鈣化病變提供了新的治療策略和理論基礎。四、構建二級響應修飾系統(tǒng)誘導小口徑TEBV神經(jīng)重建為保護netrin-1與DENND1A兩功能分子在體發(fā)揮促進神經(jīng)長入和調控長入神經(jīng)功能的作用,本研究針對小口徑TEBV植入體內(nèi)后局部特殊微環(huán)境設計構建了外層響應ROS的包裹netrin-1水凝膠和內(nèi)層響應神經(jīng)遞質ATP的包裹DENND1A水凝膠系統(tǒng)。結果發(fā)現(xiàn)TEBV在植入體內(nèi)后水凝膠可保護因子不擴散與降解,待炎癥反應發(fā)生局部產(chǎn)生ROS與水凝膠內(nèi)的硫酮基團反應后,外層膠逐漸水解釋放出netrin-1,有效促進了神經(jīng)纖維生長并導向小口徑TEBV外膜,實驗組血管外膜在14 d時已見有神經(jīng)開始長入。神經(jīng)長入TEBV后釋放神經(jīng)遞質ATP濃度逐漸增大,與內(nèi)層膠內(nèi)ATP適配體ssDNA發(fā)生反應,促使內(nèi)層膠水解,釋放DENND1A進入神經(jīng)元內(nèi),從而激活神經(jīng)元Rab35進一步促進高糖下外泌體分泌水平,顯著降低了糖尿病大鼠TEBV的鈣含量與鈣鹽沉積,提高了血流速度,有效抑制糖尿病下血管平滑肌表型轉化導致的內(nèi)膜增生與鈣化,使小口徑TEBV在糖尿病模型中保持了較長時間的通暢。本研究同時也為臨床預防、延緩及治療糖尿病血管鈣化提供了新策略。
【圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學博士論文圖 7 小口徑 TEBV 在植入體內(nèi) 30 d 早期內(nèi)皮化過程。(A)各時間段不同組小口徑 TEBV 內(nèi)膜層的掃描電鏡圖像及內(nèi)皮細胞數(shù)量統(tǒng)計。(B)與A圖中各組各時間點對應的小口徑TEBV的H&E圖像，n=10。3.2.6 netrin-1 修飾的小口徑 TEBV 保持長期通暢3.2.6.1 CTA、HE 等顯示 netrin-1 修飾的 TEBV 保持 14 個月通暢各組血管在植入 2，6 和 14 個月時我們首先用小動物 micro-CT（CTA）觀察其在體通暢，并進一步取出血管冷凍切片做 H＆E 染色。結果顯示 MRS 組中 TEBV 在 2個月時已完全閉塞，而 netrin-1 修飾的小口徑 TEBV 在 6 和 14 個月時仍保持通暢。 H＆E 染色還發(fā)現(xiàn)，netrin-1 修飾的小口徑 TEBV 在 14 個月時仍沒有平滑肌細胞（SMC）過度增殖和內(nèi)膜增生（圖 8）。
【學位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R54

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本文編號：2608184