【摘要】：目的:血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells,VECs)損傷在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用,而VECs自噬水平的適度調(diào)節(jié)可以減輕細(xì)胞損傷,對AS的發(fā)展具有保護(hù)作用,但其調(diào)節(jié)機(jī)制還未被闡明。MicroRNAs是一類新發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳調(diào)控因子,通過特異性下調(diào)靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程。冠心病患者外周血microRNA-214-3p(miR-214-3p)水平已被報(bào)道與病情嚴(yán)重程度相關(guān),但內(nèi)皮特異性表達(dá)的miR-214-3p在AS中的作用還沒有研究。本研究旨在探討miR-214-3p是否參與AS斑塊內(nèi)皮細(xì)胞的自噬調(diào)節(jié)并闡明其機(jī)制,以期為AS的治療提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。方法:一)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):使用高脂喂養(yǎng)ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠12周作為AS模型;利用流式細(xì)胞儀分選出CD31+的主動(dòng)脈弓段VECs后,我們檢測了細(xì)胞中miR-214-3p的表達(dá)水平和自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes,ATGs)的蛋白表達(dá)水平,并分析了miR-214-3p與ATG5和ATG12蛋白水平的相關(guān)性;進(jìn)行生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告基因測定確認(rèn)miR-214-3p的靶基因;二)體外實(shí)驗(yàn):用100μg/mL 氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)12h,然后轉(zhuǎn)染miR-214-3p模擬物/抑制劑,采用western blotting檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平;采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀測胞質(zhì)內(nèi)自噬體數(shù)目變化;免疫熒光檢測胞質(zhì)內(nèi)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B-Ⅱ(protein microtubule-associated protein 1 light chain 3B-Ⅱ,LC3B-Ⅱ)的表達(dá)量及分布;油紅O染色檢測胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)積累情況;檢測細(xì)胞對THP-1單核細(xì)胞的粘附能力;CCK-8檢測細(xì)胞活力,TUNNEL實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞凋亡,同時(shí)檢測caspase-3/cleaved caspase-3蛋白水平。結(jié)果:在AS小鼠模型中,我們發(fā)現(xiàn)血管損傷處VECs中miR-214-3p表達(dá)水平顯著上調(diào),伴隨自噬相關(guān)蛋白水平明顯下調(diào);相關(guān)性分析顯示miR-214-3p與ATG5和ATG12蛋白水平呈負(fù)相關(guān)(R=0.461,p=0.003;R=0.412,p=0.013);在體外實(shí)驗(yàn)中,我們觀察到ox-LDL可以誘導(dǎo)群體倍增數(shù)(Population Doublings,PDL)為5的年輕HUVECs的自噬,同時(shí)miR-214-3p水平降低;過表達(dá)miR-214-3p可以抑制ox-LDL誘發(fā)的自噬,表現(xiàn)為ATG5、ATG12-ATG5、ATG12和LC3B-Ⅱ蛋白水平下降,SQSTM1/P62蛋白水平升高,胞質(zhì)內(nèi)LC3B-Ⅱ熒光強(qiáng)度減弱及自噬體數(shù)目減少;過表達(dá)miR-214-3p可以降低PDL5 HUVEC的細(xì)胞活力,并增加細(xì)胞凋亡;此外,miR-214-3p還能促進(jìn)胞質(zhì)中脂質(zhì)積聚和THP-1細(xì)胞粘附;相反,在PDL36的衰老HUVECs中,ox-LDL刺激后表現(xiàn)為細(xì)胞自噬被抑制,同時(shí)miR-214-3p水平升高;低表達(dá)miR-214-3p可以恢復(fù)ox-LDL抑制的自噬,增加細(xì)胞活力,減少細(xì)胞凋亡,同時(shí)胞質(zhì)中脂質(zhì)積累和THP-1細(xì)胞粘附均減少。結(jié)論:在小鼠AS模型中,血管損傷處miR-214-3p水平顯著上升,其水平與自噬蛋白ATG5和ATG12水平負(fù)相關(guān);體外實(shí)驗(yàn)中,miR-214-3p可以通過抑制HUVECs中ox-LDL刺激的自噬水平,從而損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能,其作用可能是通過直接靶向作用于ATG5實(shí)現(xiàn)的,該調(diào)節(jié)途徑可能為治療AS中內(nèi)皮細(xì)胞的損傷提供新的靶點(diǎn)。
【圖文】：

４．１．１動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型的建立逡逑喂養(yǎng)１２周后，動(dòng)脈粥樣硬化（ＡＳ）小鼠的平均體重明顯高于對照組（ＣＴＬ）逡逑小鼠（圖４．１Ａ）；邋ＡＳ組血清血脂四項(xiàng)指標(biāo)ＴＧ、ＴＣ、ＨＤＬ－Ｃ和ＬＤＬ－Ｃ水平分別為逡逑（２．２５±０．６０）ｍｍｏｌ／Ｌ、（２７．３２±５．１３）ｍｍｏｌ／Ｌ、（２．３８±０．３２）ｍｍｏｌ／Ｌ邋和（２０．１２±４．０２）逡逑ｍｍｏｌ／Ｌ，ＣＴＬ組血清血脂四項(xiàng)指標(biāo)ＴＧ、ＴＣ、ＨＤＬ－Ｃ和ＬＤＬ－Ｃ水平分別為（Ｌ０８±０．２１）逡逑ｍｍｏｌ／Ｌ、（５．１０±１．１２）邋ｍｍｏｌ／Ｌ、（４．２９±０．４５）邋ｍｍｏＩ／Ｌ邋和（０．８１邋士０．１６）邋ｍｍｏｌ／Ｌ；邋ＡＳ逡逑組ＴＧ、ＴＣ和ＬＤＬ－Ｃ水平明顯高于ＣＴＬ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＜０．０５）；邋ＡＳ組逡逑血清ＨＤＬ－Ｃ水平明顯低于ＣＴＬ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＜０．０５）（圖４．１Ｂ）；光鏡逡逑下，ＡＳ小鼠主動(dòng)脈弓段血管可見明顯的黃白色脂質(zhì)斑塊形成，管腔形狀狹窄、不逡逑規(guī)則，ＣＴＬ小鼠主動(dòng)脈弓段血管未見脂質(zhì)沉積，管腔光滑、通暢（圖４．１Ｃ）；主動(dòng)逡逑脈弓段血管石蠟切片ＨＥ染色可見，ＡＳ小鼠血管腔內(nèi)有明顯脂質(zhì)斑塊內(nèi)凸生長，逡逑造成管腔面積比ＣＴＬ小鼠明顯減少（圖４．１Ｄ），，量化分析血管損傷區(qū)域管腔橫截面逡逑面積發(fā)現(xiàn)

胞（ＶＥＣｓ邋）后，我們用ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法檢測兩組小鼠ＶＥＣｓ中自喔相關(guān)基因逡逑的蛋白表達(dá)水平差異。我們發(fā)現(xiàn)與ＣＴＬ俎相比，ＡＳ組ＶＥＣｓ中自噬相關(guān)基因ＡＴＧ５、逡逑ＡＴＧ１２和ＡＴＧ１２－ＡＴＧ５復(fù)合物的蛋白表達(dá)水平均明顯降低（圖４．２Ａ－Ｂ）邋（ｐ＜０．０５）；逡逑ＬＣ３Ｂ－Ｉ和ＬＣ３Ｂ－ＩＩ的蛋白表達(dá)水平明顯降低（圖４．２Ａ－Ｂ）（尸＜０．０５）；以上結(jié)果均逡逑提示ＡＳ組小鼠ＶＥＣｓ的自噬水平受到抑制；兩組小鼠ＶＥＣｓ中ｂｅｃｌｉｎ－１的蛋白表逡逑達(dá)水平無明顯差異（圖４．２Ａ－Ｂ）邋（ｐ＞０．０５邋）；與ＣＴＬ組相比，ＡＳ組ＶＥＣｓ中逡逑ＳＱＳＴＭｌ／ｐ６２的蛋白表達(dá)水平明顯升高（圖４．２Ａ－Ｂ）（尸＜０．０５），ＳＱＳＴＭｌ／ｐ６２的蛋白逡逑降解減少，ＳＱＳＴＭｌ／ｐ６２是反映自噬流的較好指標(biāo)，說明ＡＳ組小鼠ＶＥＣｓ中自噬逡逑流減弱。以上結(jié)果提示，相比于ＣＴＬ組小鼠，ＡＳ姐小鼠ＶＥＣｓ中存在明顯的自噬逡逑水平抑制，且自噬流減少。逡逑Ａ邐邋Ｂ邐□ＣＴＬ逡逑■邋ＬＯＢＩ邐ｃ邐□邋ＡＳ逡逑■■■邋＃ｌｉＭＣ邋ＬＣ３Ｂ－ＩＩ邐．２邐２邋５７邐７逡逑－Ｉ邐ｇ邐ｔ逡逑ｒｎｒｎｍｍｍ邋ｂｅｃｌｉｍ邐Ｉ邐２邋0－邐—＂１逡逑二邐■■■■■｛邐ｗ邋１５．邐邋－逡逑ＡＴＧ５逡逑■■■＝邐＝＝｛邐￡邋ｉ邋１１！邐ｒＳ邋Ａ．邋ｔＶ邋ｒＶ邋ｒＶ逡逑邐＾｜ＡＴＣ．２－ＡＴＣＳ邐－邐十？邐ｉ邋ｉ邋卞逡逑ＪＬ邋Ｉ邋Ｊｌ邋＇逡逑■丨．丨■■＂邐１邐ＱＣ邋０邋０邋、一＾邋＾邋＊邋．１＾邋ＩｊＵ邋Ｙ－Ｊ一—邋Ｙ－Ｂ逡逑？

本文編號(hào)：2597813