【摘要】：研究背景:冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病又稱為冠心病(CHD),主要原因?yàn)楣跔顒?dòng)脈血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化并且引起其血管腔狹窄或阻塞,繼而造成心肌缺血、缺氧甚至壞死而導(dǎo)致的心血管疾病。急性心肌梗死(AMI)是一種危急的冠心病,為病人死亡的常見病因。脂質(zhì)的異常代謝以及炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化與并發(fā)癥(包括CHD和AMI)的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[1,2]。AMI是由環(huán)境和遺傳因素交互作用共同導(dǎo)致的。目前全基因組研究已經(jīng)鑒定出了大量與CHD和AMI相關(guān)的基因位點(diǎn),但是這些基因位點(diǎn)只能解釋10%的病例[3-5]。自噬為溶酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)與細(xì)胞器官降解的高度保守的機(jī)制,其在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)自噬對(duì)缺血心肌存在保護(hù)性作用,同時(shí)自噬可以抑制心肌重構(gòu),從而減少心肌組織壞死面積[6]。自噬能清除受損蛋白以及細(xì)胞器等,對(duì)保證細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要,但是自噬過度可能會(huì)降解細(xì)胞生存所需重要的蛋白或細(xì)胞器。轉(zhuǎn)錄因子TFEB為螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈bHLH-LZ類轉(zhuǎn)錄因子,同TFEC,TFE3,及MITF均屬M(fèi)iTF/TFE家族[7,8]。TFEB在基本細(xì)胞過程調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用,例如溶酶體生物發(fā)生和自噬[9]。TFEB基因的過度表達(dá)顯著增加自噬體的產(chǎn)生以及溶酶體相關(guān)蛋白的表達(dá)[10]。因此,我們通過研究AMI患者和健康人群中TFEB基因啟動(dòng)子區(qū)域序列變異,進(jìn)而給AMI的治療提供遺傳學(xué)方面的支持。研究目的:通過測(cè)序,在急性心肌梗死患者和健康對(duì)照中發(fā)現(xiàn)TFEB基因啟動(dòng)子低頻率遺傳突變和單核苷酸多態(tài)性,構(gòu)建TFEB基因啟動(dòng)子突變位點(diǎn)的pGL3-basic報(bào)告基因載體,研究TFEB基因啟動(dòng)子區(qū)域的序列變異以及功能變異對(duì)急性心肌梗死發(fā)展的影響。研究方法:1、應(yīng)用大樣本病例對(duì)照的方法,納入急性心肌梗死病人352例,同期進(jìn)行查體的健康對(duì)照病人337例,分別收集兩組人群的臨床資料。從納入樣本的外周血白細(xì)胞中提取全基因組DNA。2、通過NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù),查找分析TFEB基因啟動(dòng)子區(qū)域序列,進(jìn)行引物合成,使用PCR反應(yīng)對(duì)靶基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,并通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。將TFEB基因啟動(dòng)子野生型靶片段和序列突變位點(diǎn)分別構(gòu)建到PGL3-basic報(bào)告載體中。然后通過脂質(zhì)體包裹將構(gòu)建成功的pGL3報(bào)告基因載體連同內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK 一起瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK-293和H9C2細(xì)胞中,收集細(xì)胞好裂解液并通過雙熒光報(bào)告基因分析儀進(jìn)行分析,通過雙熒光素報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)螢火蟲熒光素酶同海腎熒光素酶的活性,探索TFEB基因啟動(dòng)子區(qū)域變異對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性的影響。3、我們使用TRANSFAC program分析TFEB基因啟動(dòng)子區(qū)域低頻變異是否影響某些假定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,對(duì)比正常序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子以及突變處結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的改變。4、采用生物素標(biāo)記的TFEB基因啟動(dòng)子正常寡核苷酸序列和突變序列的探針,通過EMSA實(shí)驗(yàn)分析基因序列的變異對(duì)與其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的影響。研究結(jié)果:1、實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中測(cè)序共發(fā)現(xiàn)15個(gè)DNA序列變異(DSVs)位點(diǎn),在AMI組發(fā)現(xiàn)2個(gè)新的DSVs和4個(gè)SNPs,分別為DSVs(g.41737144 AG、g.41736544CT)和4個(gè)SNPs[g.41737274TC(rs533895008)、g.41736987CT(rs76029 3138)、g.41736806CT(rs748537297)、g.41736635TC(rs975050638)]。在對(duì)照組中同樣發(fā)現(xiàn)4個(gè)新的DSVs和2個(gè)SNPs,分別為DSVs(g.41737451TG、g.41736981AG、g.41736407CT、g.41736218TG)和2個(gè)SNPs[g.41737034CA(rs73733015)、g.41737005GA(rs14916635 8)]。AMI組與對(duì)照組中均發(fā)現(xiàn)兩個(gè)DSVs和2個(gè)SNP,分別為DSVs(g.41737034GA、g.41736740CA)和 1個(gè)SNP[g.41737 034GC(rs7373 3015)],均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.5)。2、將變異位點(diǎn)構(gòu)建pGL3-basic報(bào)告基因載體,如下為pGL3-WT(wild-type TFEB基因啟動(dòng)子)、pGL3-41737451G、pGL3-41737274C、pGL3-41737144G、pGL3-41737034C、pGL3-41737034A、pGL3-41737005A、pGL3-41736987T、pGL3-41736981G、pGL3-41736806T、pGL3-41736635、pGL3-41736544T、pGL3-.41736407T和pGL3-41736218G。3、構(gòu)建pGL3-basic報(bào)告基因載體,將構(gòu)建好的報(bào)告基因載體與pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒體外共轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞系和H9C2細(xì)胞系,檢測(cè)不同DSVs和SNPs的相對(duì)熒光素酶活性。(1)轉(zhuǎn)染HEK-293我們檢測(cè)到,AMI組內(nèi)的6個(gè)DSVs和SNPs均能明顯改變TFEB基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,其中SNP[g.41736987CT(rs760293138)]顯著減低了TFEB基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(P0.01),而DSVs[g.41737144 AG,g.41736544CT]以及SNPs[g.41737274TC(rs533895008),g.41736987CT(rs760 293138),g.41736806CT(rs748537297),g.41736635TC(rs9750506380)]顯著增加了TFEB基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(P0.01)。在對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)的4個(gè)DSVs[g.41 737451TG,g.41736981AG,g.41736 407CT,g.41736218TG]和2個(gè)SNPs[g.41737005GA(rs149166358),g.41737034CA(rs73733015)]以及實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中均存在的SNP[g.41737034GC(rs73733015)]均未對(duì)TFEB基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性造成影響(P0.05)。(2)轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)結(jié)果與HEK-293細(xì)胞中結(jié)果一致,存在于AMI組內(nèi)6個(gè)DSVs和SNPs顯著改變了TFEB基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,其中SNP[41736987CT(rs760293138)]減低了TFEB基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(P0.05),而DSVs[g.41737144 AG,g.41736544CT]以及SNPs[g.41737274TC(rs533895 008),g.41736987CT(rs7 60293138),g.41736806CT(rs748537297),g.41736635 TC(rs9750506380)]增加了TFEB基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(P0.05)。在對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)的4個(gè)DSVs[g.41737451TG,g.41 736981AG,g.41736407CT,g.417 36218TG]和2個(gè)SNPs[g.41737005GA(rs14916 6358),g.41737034CA(rs7373 3015)]以及實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中均存在的SNP[g.41737034 GC(rs73733015)]均未能對(duì)TFEB基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性造成影響(P0.05)。4、推測(cè)TFEB基因啟動(dòng)子DSVs影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,通過TRANSFAC program分析TFEB基因啟動(dòng)子序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,推測(cè)SNP[g.41737274TC(rs533895008)]可能消除了轉(zhuǎn)錄因子HMGA factors和NF-Y的結(jié)合位點(diǎn),增加了轉(zhuǎn)錄因子NR-DR、TGF-7和BRCA1的結(jié)合位點(diǎn)。DSV[g.41737144AG]可能修飾了轉(zhuǎn)錄因子 BRCA1 和 SREBP factors 結(jié)合位點(diǎn)。SNP[g.41736987CT(rs76029313 8)]可能修飾了轉(zhuǎn)錄因子CBF-1/RBP-J的結(jié)合位點(diǎn)。SNP[g.41736806CT(rs748537297)]可能增加了轉(zhuǎn)錄因子PPARGAMMA的結(jié)合位點(diǎn)。SNP[g.41736635TC(rs975050638)]消除了轉(zhuǎn)錄因子GFI1 factor的結(jié)合位點(diǎn),增加了轉(zhuǎn)錄因子GR-like receptors的結(jié)合位點(diǎn)。DSV(g.41736544CT)可能修飾了轉(zhuǎn)錄因子SREBP和GR-like receptors結(jié)合位點(diǎn)。5、凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)結(jié)果顯示SNP[g.41737274TC(rs533895008)]改變了原有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合,出現(xiàn)了新的轉(zhuǎn)錄因子。DSV(g.41737144AG)、SNP[g.41736987CT(rs760293138)]和DSV(g.41736544CT)增強(qiáng)了原有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。而SNP[g.41736806CT(rs74853729)]和SNP[g.41736635TC(rs975050638)]沒有影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。因此,我們推測(cè)上述DSVs和SNPs可能通過改變或者影響某些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合進(jìn)而導(dǎo)致TFEB基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生變化。研究結(jié)論:在本研究中,對(duì)TFEB基因啟動(dòng)子進(jìn)行遺傳和功能分析。在AMI患者中鑒定出兩個(gè)DSVs和四個(gè)SNPs,其顯著改變了 TFEB基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。此外,兩個(gè)DSVs和兩個(gè)SNPs明顯影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。因此,這些DSVs和SNPs可能會(huì)改變TFEB基因表達(dá)水平,作為低頻風(fēng)險(xiǎn)因素促進(jìn)AMI的發(fā)展。
【圖文】：

邐山東大學(xué)碩士學(xué)位論文ＭＭＭＷ＇邋＇＂邋＇邋—ｍｉＢＢ￣＂＂■＿．．Ｊ．Ｌ？Ｊｌ．．．ｉ．ｉ」ｍａ＾．－．－．．，‘Ｔ＾｜＾ｊｐｎ．．．■■．邋—邐ｉ逡逑邐—：邐邋＇／Ｊ邐：邐＾－＾Ｓ逡逑圖１－Ｂ邋ＴＦＥＢ基因啟動(dòng)子片段２（８０１ｂｐ）凝膠電泳結(jié)果。１－６泳道為部分樣本凝泳結(jié)果，７泳道為Ｄ２０００邋Ｐｌｕｓ邋ｍａｒｋｅｒ。根據(jù)圖，目的片段的大小符合。逡逑ｇ．４１７３７００５Ｇ＞Ａ逡逑

圖１－Ｂ邋ＴＦＥＢ基因啟動(dòng)子片段２（８０１ｂｐ）凝膠電泳結(jié)果。１－６泳道為部分樣本凝膠電逡逑泳結(jié)果，７泳道為Ｄ２０００邋Ｐｌｕｓ邋ｍａｒｋｅｒ。根據(jù)圖，目的片段的大小符合。逡逑ｇ．４１７３７００５Ｇ＞Ａ逡逑ｇ．４１７３７０３４Ｇ＞Ｃ／Ｇ＞Ａ邐ｇ．４１７３６９８７Ｃ＞Ｔ邐ｇ．４１７３６６３５Ｔ＞Ｃ逡逑ｇ．４１７３７０３４Ｇ＞Ａ邐ｇ．４１７３６９８１邋Ａ＞Ｇ邐ｇ．４１７３６５４４Ｃ＞Ｔ逡逑ｇ．４１７３７０３４Ｇ＞Ｃ邐ｇ．４１７３６８０６Ｃ＞Ｔ邐ｇ．４１７３６４０７Ｃ＞Ｔ逡逑ｇ．４１７３７２７４Ｔ＞Ｃ邐ｇ．４１７３６２１８Ｔ＞Ｇ逡逑Ｉ邐ｉ邐逡逑４邐？邐１￣１邐Ｔ？ｔ邐ｌ＿±＿＿邋＿ｌｉ邐邐Ｌ＿ｉ邐１邋ｅｘｏｎｌ逡逑－１２００邐－１０００邋Ｉ邋－８００邐－６００邐－４００邐－２００邐＋１逡逑ｇ．４１７３７４５１Ｔ＞Ｇ邐ｇ．４１７３７１４４Ａ＞Ｇ邐ｇ．４１７３６７４０Ｃ＞Ａ逡逑圖２對(duì)照組和心肌梗死組病人中ＴＦＥＢ基因啟動(dòng)子區(qū)域ＤＳＶｓ和ＳＮＰｓ位置圖，數(shù)字代逡逑表人ＴＦＥＢ基因的基因組ＤＮＡ序列，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（ＴＳＳ）位于４１７３６２５９邋（＋１）在第逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R542.22

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2 張丹;基于單個(gè)T淋巴細(xì)胞的手工顯微分離及TCR基因的克隆[D];廣東藥科大學(xué);2018年

3 張宇;黑曲霉形態(tài)相關(guān)基因brsa-25基因的敲除[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

4 青柏（Tsimbai）;基于基因分型對(duì)蒙古斑點(diǎn)馬選配方案的制定[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

5 李長(zhǎng)青;黑曲霉葡萄糖氧化酶基因片段的克隆及序列分析[D];大連工業(yè)大學(xué);2014年

6 劉欣欣;旅行商問題的基因片段插入算法研究[D];閩南師范大學(xué);2015年

7 張菊;果膠酶基因片段的克隆及其表達(dá)載體構(gòu)建[D];大連工業(yè)大學(xué);2011年

8 楊利玲;蝙蝠腦組織中BDV-p24基因片段和抗原的檢測(cè)[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2016年

9 王好;犬瘟熱病毒H蛋白基因片段的克隆與原核表達(dá)[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

10 韋顯凱;豬流行性腹瀉病毒S蛋白不同基因片段重組腺病毒的構(gòu)建與小鼠免疫特性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2597579