【摘要】：目的:吸煙作為心血管損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素嚴(yán)重危害人體健康。本實(shí)驗(yàn)通過體外研究尼古丁對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響而模擬在體吸煙對(duì)心血管損傷的模型,進(jìn)而探討尼古丁引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷機(jī)制,通過明確尼古丁對(duì)自噬流及凋亡的影響進(jìn)而揭示尼古丁與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂之間的關(guān)系。方法:用尼古丁干預(yù)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,模擬在體吸煙模型。1.檢測(cè)尼古丁對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和自噬的影響,將HUVECs隨機(jī)分組:空白對(duì)照組、尼古丁組(6×10~(-6) M)/氯喹組(CQ)和氯喹與尼古丁組(CQ+NIC),采用蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3及自噬小體標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ和自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、SQSTM1/p62、LAMP2的蛋白表達(dá)水平;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率。2.檢測(cè)尼古丁抑制自噬的信號(hào)通路,將HUVECs隨機(jī)分為五組:空白對(duì)照組、尼古丁組(15 min、30 min、60 min)、α7nAChR基因沉默組(α7nAChR siRNA+NIC),采用Western Blot方法檢測(cè)AMPKα和ERK1/2、JNK、p38 MAPK的磷酸化水平;使用AMPKαsiRNA和ERK1/2/p38 MAPK抑制劑后,采用Western Blot方法檢測(cè)SQSTM1/p62、LAMP2的蛋白表達(dá)水平。3.檢測(cè)ROS是否抑制自噬流自噬小體的清除,將HUVECs隨機(jī)分為三組:對(duì)照組、尼古丁組(NIC)、α7nAChR基因沉默組(α7nAChR siRNA+NIC)/ROS清除劑組(NAC+NIC),采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成;采用Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SQSTM1/p62、LAMP2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.尼古丁通過增加cleaved caspase-8(外源性凋亡途徑)和cleaved caspase-3的活化及細(xì)胞凋亡率,進(jìn)而促進(jìn)HUVECs凋亡;尼古丁通過減少Beclin-1和LAMP2、增加LC3Ⅱ、SQSTM1/p62的蛋白表達(dá),進(jìn)而主要抑制自噬流自噬小體清除,使細(xì)胞內(nèi)自噬流受阻。與空白對(duì)照組相比,尼古丁處理后cleaved caspase-9(線粒體凋亡途徑)蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),cleaved caspase-8和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)都顯著增加(P0.01),細(xì)胞凋亡率也與cleaved caspase-3有相同的變化趨勢(shì)(P0.01)。與空白對(duì)照組相比,自噬小體標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ蛋白表達(dá)水平在尼古丁處理后增加(P0.01)。氯喹處理后LC3Ⅱ蛋白表達(dá)顯著增加(P0.01),而氯喹預(yù)處理后尼古丁引起的細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ蛋白表達(dá)并沒有進(jìn)一步增加(P0.05);尼古丁組中SQSTM1/p62的蛋白表達(dá)與LC3Ⅱ蛋白表達(dá)變化相一致(P0.05),而Beclin-1和LAMP2的蛋白表達(dá)水平相比對(duì)照組降低(P0.05)。2.尼古丁通過α7nAChR(尼古丁血管內(nèi)皮細(xì)胞膜受體)激活A(yù)MPKα、ERK1/2/p38 MAPK信號(hào),但信號(hào)的活化并不影響尼古丁對(duì)自噬流的抑制作用。與對(duì)照組相比,AMPKα和ERK1/2/p38 MAPK在尼古丁處理的各時(shí)間點(diǎn)都有磷酸化水平的增加,其中AMPKα在尼古丁干預(yù)30 min時(shí)磷酸化水平最高(P0.01),而ERK1/2/p38 MAPK磷酸化水平最高則出現(xiàn)在尼古丁干預(yù)15 min時(shí)(P0.01)。用α7nAChR siRNA處理后,與尼古丁處理30 min或15 min相比,AMPKα、ERK1/2/p38 MAPK磷酸化水平明顯下降,而與對(duì)照組相比,JNK在60 min內(nèi)磷酸化水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與尼古丁組相比,AMPKα基因沉默時(shí)SQSTM1/p62和LAMP2蛋白表達(dá)無明顯變化(P0.05)。此外,p38 MAPK抑制劑SB203580與ERK1/2抑制劑PD98059預(yù)處理后SQSTM1/p62和LAMP2蛋白表達(dá)水平也無明顯變化(P0.05);而α7nAChR沉默后,SQSTM1/p62和LAMP2的蛋白表達(dá)與尼古丁組相反(P0.05)。3.尼古丁通過促進(jìn)HUVECs內(nèi)ROS生成,進(jìn)而抑制自噬流自噬小體的清除。與對(duì)照組相比,尼古丁組HUVECs內(nèi)ROS生成顯著增加(P0.01);沉默α7nAChR后細(xì)胞內(nèi)ROS生成明顯減少(P0.01)。與尼古丁組相比,ROS清除劑(NAC)組SQSTM1/p62蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.01),而LAMP2蛋白表達(dá)明顯增加(P0.01)。結(jié)論:1.尼古丁可通過外源性凋亡途徑而非內(nèi)源性線粒體凋亡途徑促進(jìn)HUVECs凋亡,且對(duì)自噬有調(diào)節(jié)作用,其中自噬小體的生成和降解都受阻,特別是抑制自噬流自噬小體的清除。2.尼古丁通過結(jié)合細(xì)胞膜α7nAChR增加AMPKα和ERK1/2/p38 MAPK的磷酸化水平,但尼古丁對(duì)自噬小體清除的抑制作用并非通過AMPKα和ERK1/2/p38MAPK依賴途徑。3.尼古丁通過促進(jìn)HUVECs內(nèi)ROS的過量生成,進(jìn)而抑制自噬流自噬小體的清除。
【圖文】：

2 結(jié) 果2.1 尼古丁增加 HUVECs 凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及細(xì)胞凋亡率HUVECs 分為空白對(duì)照組、尼古丁組，尼古丁干預(yù) 24 h 后采用 Western Blot檢測(cè) cleaved caspase-9、cleaved caspase-8 和 cleaved caspase-3 的蛋白表達(dá)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率。結(jié)果如圖 1-1 所示，尼古丁處理后 cleavedcaspase-8 和 cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)水平相比對(duì)照組顯著增加（P<0.01），而cleaved caspase-9 蛋白幾乎沒表達(dá)（P>0.05）；圖 1-2 顯示，相比空白對(duì)照組，尼古丁干預(yù)后血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率顯著增加（P<0.01），這與凋亡蛋白的檢測(cè)結(jié)果（圖 1-1）一致，提示尼古丁通過外源性而非內(nèi)源性線粒體凋亡途徑促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

圖 1-2 尼古丁對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的影響（x±s, n＝6）注：與 CON 組相比 **P<0.01.2 尼古丁對(duì)自噬的調(diào)節(jié)作用HUVECs 分為正常對(duì)照組（CON），尼古丁組（NIC），氯喹組（25 mM，CQ喹+尼古丁組（CQ+NIC）。Western Blot 檢測(cè) LC3Ⅱ蛋白表達(dá)變化。結(jié)果如-3 所示，與正常對(duì)照組相比，尼古丁處理組 LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著增P<0.01）；氯喹組 LC3Ⅱ蛋白表達(dá)也顯著增加，而氯喹預(yù)處理尼古丁組 LC3白表達(dá)相比氯喹單獨(dú)處理組并無明顯改變（P>0.05），，這提示尼古丁作用下內(nèi)自噬小體大量堆積，自噬流嚴(yán)重受阻。與此同時(shí)，進(jìn)一步檢測(cè)了自噬相關(guān)蛋白 Beclin-1、SQSTM1/p62、LAMP2白表達(dá)變化。結(jié)果如圖 1-4 所示，與空白對(duì)照組相比，尼古丁處理后 Becli
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2593740