【摘要】：目的利用Ad-HMGB1-shRNA體外下調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)高遷移率族蛋白B1(High Mobility Group Box 1,HMGB1),觀察HMGB1作為DNA分子伴侶,參與并調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的過(guò)程,初步研究其潛在的分子機(jī)制,通過(guò)構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎(Experimental autoimmune myocarditis,EAM)小鼠模型,闡明胞內(nèi)HMGB1在EAM發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中,對(duì)浸潤(rùn)心肌組織的巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控機(jī)制。方法(1)篩選干擾片段:設(shè)計(jì)三條干擾序列,構(gòu)建并包裝重組腺病毒,體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,于對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)三組重組腺病毒的轉(zhuǎn)染效率。(2)胞內(nèi)HMGB1對(duì)巨噬細(xì)胞極化及抗原加工提呈能力的影響:進(jìn)行成功轉(zhuǎn)染后,利用Western Blot檢測(cè)LPS刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞和小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞中一氧化氮合酶(iNOS)蛋白水平;酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清炎癥介質(zhì)分泌量;于體外單染CD86和MHCⅡ分子后,用流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)檢測(cè)巨噬細(xì)胞抗原加工提呈能力。(3)胞內(nèi)HMGB1對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,ANG II)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化的影響:Ad-HMGB1-shRNA成功下調(diào)胞內(nèi)HMGB1,ANG II體外作用12h,利用Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)水平;FCM檢測(cè)抗原加工提呈的變化;ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液中M1型相關(guān)因子的分泌情況。(4)胞內(nèi)HMGB1影響巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制:成功下調(diào)胞內(nèi)HMGB1后再給予ANG II刺激細(xì)胞30 min,利用Western Blot檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子KappaB(nuclear transcription factor KappaB,NF-κB)、蛋白激酶ERK1/2、P38的磷酸化水平。(5)重組AAV感染EAM小鼠模型的構(gòu)建:將3周齡的雄性BALB/c小鼠分為Control組(野生組)、EAM+AAV-HMGB1組(實(shí)驗(yàn)組)、EAM+AAV-Ns組(陽(yáng)性對(duì)照組),小鼠尾靜脈注射病毒懸液,每10天注射一次,共計(jì)兩次。利用制備的抗原肽免疫小鼠,建立EAM模型。41天后建模結(jié)束,取出小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況,確定感染效率。(6)AAV-HMGB1對(duì)EAM小鼠心肌組織炎癥的治療:將取出的心臟送往醫(yī)院病理科,將進(jìn)行心肌組織切片后,進(jìn)行HE染色和病理評(píng)分;ELISA測(cè)定血清中炎癥因子分泌變化;免疫熒光檢測(cè)EAM小鼠心肌組織中F4/80~+CD86~+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的情況。結(jié)果(1)重組腺病毒可明顯下調(diào)巨噬細(xì)胞HMGB1蛋白水平以及mRNA水平,轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上。(2)Western Blot結(jié)果顯示:成功下調(diào)胞內(nèi)HMGB1后,實(shí)驗(yàn)組iNOS蛋白表達(dá)量明顯少于對(duì)照組。ELISA顯示實(shí)驗(yàn)組炎癥因子分泌減少,且與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。通過(guò)FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞抗原加工提呈能力亦受到抑制。(3)Western Blot、ELISA和FCM檢測(cè)結(jié)果顯示:下調(diào)胞內(nèi)HMGB1后可減少iNOS、炎性介質(zhì)以及CD86、MHCⅡ分子的表達(dá),即可有效逆轉(zhuǎn)ANG II所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1型極化。(4)預(yù)先成功下調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)HMGB1后,再以ANG II進(jìn)行作用,與對(duì)照組相比,NF-κB、ERK1/2、P38分子磷酸化水平均呈現(xiàn)下降趨勢(shì),實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(5)成功構(gòu)建重組AAV感染的EAM小鼠模型。(6)AAV-HMGB1進(jìn)行治療后,EAM小鼠心肌組織病理評(píng)分、血清中炎性因子分泌、F4/80~+CD86~+M1型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)均顯著低于對(duì)照組。結(jié)論(1)體外運(yùn)用Ad-HMGB1-shRNA下調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)HMGB1能有效逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞向促炎的M1型極化,減少炎癥介質(zhì)分泌,此過(guò)程依賴于轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、蛋白激酶ERK1/2、P38信號(hào)分子通路進(jìn)行調(diào)控。(2)AAV-HMGB1可顯著減少實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎小鼠心肌組織中F4/80~+CD86~+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、降低血清中炎性因子含量,進(jìn)而緩解心肌炎癥的發(fā)展,對(duì)疾病起到一定治療作用。
【圖文】：

江 蘇 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文同狀態(tài)間的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換，當(dāng)炎癥過(guò)強(qiáng)時(shí)，則易誘發(fā)多種自身免疫用過(guò)強(qiáng)，則無(wú)法有效清除病原體。因此正常的機(jī)體需要維持巨衡[27-29]。的疾病微環(huán)境下，M1、M2巨噬細(xì)胞會(huì)表達(dá)出不同的功能表型我們將在M1巨噬細(xì)胞中特異高表達(dá)的基因群稱為M1基因群，在高表達(dá)的基因群稱為M2基因群。這些特異基因群的表達(dá)產(chǎn)物2型的標(biāo)志分子。M1型的標(biāo)記分子較多，，有iNOS、 IL-6、TNF-的標(biāo)記物主要有Arg-1、CD206等。M1型和M2型巨噬細(xì)胞是極，因此巨噬細(xì)胞的可塑性還有待進(jìn)一步的研究與探討[30, 31]。

染色質(zhì)的能力不同，獨(dú)立的功能結(jié)構(gòu)域已可捆綁 DNA 共價(jià)鍵的形式連接時(shí)這種捆綁功能將大大增強(qiáng)[63, 64]。核內(nèi)核染色質(zhì)捆綁位點(diǎn)上存在著競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，在受到外界刺激時(shí)替代 H1 對(duì)核染色質(zhì)的捆綁作用，HMGB1 捆綁核小體后、重構(gòu)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。并且 HMGB1 是目前發(fā)現(xiàn)的最活躍要 1-2 s 即可穿過(guò)細(xì)胞核，這意味著 HMGB1 的這種綁定1 可在短暫的時(shí)間內(nèi)重構(gòu)核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)相應(yīng) DNA 時(shí)靶位點(diǎn)處發(fā)生均等的彎曲，這種高度濃縮的超分子結(jié)序列被進(jìn)一步暴露，進(jìn)而核內(nèi)許多生物活性的蛋白質(zhì)被 修復(fù)蛋白、轉(zhuǎn)錄激活因子、共抑制因子和許多轉(zhuǎn)錄因子：NF-κB/Rel 家族、p53/p73 等[65-67]。因此細(xì)胞內(nèi) HMGB體相互作用替代了組蛋白 H1 使得核小體重塑，增強(qiáng)核小的親和性，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的發(fā)生，調(diào)控相應(yīng)性狀的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R542.2

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本文編號(hào)：2593597