【摘要】：第一部分肌凝蛋白誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生自身免疫性心肌炎模型的構(gòu)建背景心血管疾病因為發(fā)病率高,致死率高,嚴(yán)重威脅著人類的健康。全球每年有超過1730萬人死于各類心血管疾病,這其中有2%的是各種心臟炎癥性疾病。心肌炎臨床癥狀多樣,許多會發(fā)展成擴張性心肌病。多種感染性因素和非感染性因素均可誘發(fā)心肌炎,但是到目前為止,心肌炎的病因尚不清楚,臨床上對心肌炎的發(fā)生和進(jìn)展缺乏有效的干預(yù)手段。研究表明,持續(xù)的免疫應(yīng)答在心肌炎的進(jìn)展過程中起著重要的促進(jìn)作用。多種動物模型被用來研究心肌炎。穩(wěn)定、可靠的動物模型對于探討自身免疫性心肌炎的發(fā)病機制非常重要。目的驗證肌凝蛋白誘導(dǎo)法建立小鼠自身免疫性心肌炎模型的穩(wěn)定性、可靠性和應(yīng)用價值。方法小鼠皮下注射嚙齒類動物心臟肌凝蛋白與完全弗氏佐劑混合物誘導(dǎo)自身免疫性心肌炎。小鼠分組：取40只8-12周齡BALB/C野生型小鼠,按隨機分組原則將小鼠分為4組,具體分組如下：空白對照組(A)：雌性BALB/C小鼠10只不加任何處理。低濃度EAM模型組(B)：雌性BALB/C小鼠10只,嚙齒類動物心肌肌凝蛋白重鏈氨基酸片段與弗氏佐劑混合物25μg/200μl。中濃度EAM模型組(C)：雌性BALB/C小鼠10只,嚙齒類動物心肌肌凝蛋白重鏈氨基酸片段與弗氏佐劑混合物50μg/200pl。高濃度EAM模型組(D)：雌性BALB/C小鼠10只,嚙齒類動物心肌肌凝蛋白重鏈氨基酸片段與弗氏佐劑混合物100μ,g/200μl。EAM組小鼠注射氨基酸-弗氏佐劑混合物,空白對照組同樣部位注射PBS。與對照組小鼠比較心肌炎的發(fā)生率、心臟質(zhì)量/體重的比值、心臟病理學(xué)改變。結(jié)果小鼠心肌質(zhì)量/體重以及心肌病理學(xué)改變呈濃度依賴性增加,正常對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組心肌炎的發(fā)生率分別為0/10、2/10、5/10、10/10,心臟質(zhì)量/體重比例(mg/g)分別為5.53±0.21、6.16±0.32、7.04±0.53、8.16±0.87。病理學(xué)檢查是評價心肌炎癥及纖維化程度的首選方法,也是評價EAM模型的金標(biāo)準(zhǔn),四組小鼠心肌形態(tài)學(xué)評分分別為0、1.7±0.3、2.2±0.4、2.9±0.6,表明小鼠注射肌凝蛋白重鏈氨基酸片段(MyHC-α與CEA混合物,濃度在25μg/200μl-100μg/200μl的范圍內(nèi))后,成功的誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了心肌炎。結(jié)論肌凝蛋白誘導(dǎo)法能很好地模擬自身免疫性心肌炎,可用于探討自身免疫性心肌炎的機制。MyHC-α與CEA混合物濃度在100μg/200μl濃度時小鼠心肌炎發(fā)病率高,炎癥反應(yīng)典型,是最合適的處理濃度。第二部分PI3K在肌凝蛋白誘導(dǎo)的自身免疫性心肌炎小鼠心肌病理損傷中的作用背景BALB/C小鼠對a-肌凝蛋白或肌凝蛋白重鏈來源的氨基酸序列敏感性高,利用α-肌凝蛋白或肌凝蛋白重鏈來源的氨基酸免疫BALB/C小鼠,可以誘導(dǎo)小鼠自身免疫性心臟病,是自身免疫性心肌炎常用的動物模型,我們前面的研究已經(jīng)證實肌凝蛋白誘導(dǎo)法能建立穩(wěn)定、可靠的自身免疫性心肌炎動物模型。慢性自身免疫性反應(yīng)是介導(dǎo)心肌炎發(fā)生發(fā)展的重要分子機制,然而到目前為止,介導(dǎo)該過程的具體分子機制依然不清楚,臨床依然缺乏有效的治療策略。磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphoinositide 3-kinase, PI3K)是炎癥免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中非常重要的蛋白激酶。最近幾年越來越多的研究發(fā)現(xiàn)PI3K在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用,但是PI3K是否在自身免疫性心肌炎的發(fā)生、發(fā)展中起作用還未得知。目的利用藥理學(xué)的方法抑制PI3K的活性,觀察肌凝蛋白誘導(dǎo)的實驗性自身免疫性心肌炎小鼠心肌損傷的變化,從而明確PI3K在實驗性自身免疫性心肌炎中的作用。方法為排除LY294002對生理狀態(tài)下小鼠的影響,我們首先檢測LY294002毒理作用。小鼠皮下注射嚙齒類動物心臟肌凝蛋白與完全弗氏佐劑混合物誘導(dǎo)自身免疫性心肌炎。小鼠分為三組,空白組、對照組(EAM組)和實驗組(EAM+LY組)。實驗組小鼠腹腔注射PI3K抑制劑LY294002,觀察PI3K活性被抑制后,與對照組小鼠比較心肌炎的發(fā)生率、心臟質(zhì)量／體重的比值、心臟病理學(xué)改變以及小鼠死亡率的變化。結(jié)果LY294002的毒理檢測結(jié)果表明,生理狀態(tài)下的小鼠在給予實驗中所用劑量的LY294002后,心臟、肝臟、腎臟、肺等臟器沒有發(fā)生可見的病理學(xué)損傷。小鼠注射肌凝蛋白重鏈氨基酸片段后,發(fā)生了嚴(yán)重的心肌炎細(xì)胞浸潤以及心肌壞死,心臟質(zhì)量/體重比例較正常小鼠增加(8.16±0.87 vs5.53±0.21,p0.01)小鼠死亡率高(8/10)。而給予PI3K抑制劑LY294002干預(yù)后,實驗組小鼠的心臟/體重比例明顯比對照組降低(6.04±1.03 vs 8.16±0.87,p0.05)。小鼠心肌炎性損傷明顯減輕(形態(tài)學(xué)損傷評分1.7+0.6 vs 2.9±0.6,p0.01)。小鼠的7天死亡率較對照組明顯降低(3/10 vs 8/10)。結(jié)論抑制PI3K對實驗性自身免疫性心肌炎造成的心肌損傷具有保護作用,提示PI3K信號通路可能是治療自身免疫性心肌炎的潛在靶點。第三部分PI3K在肌凝蛋白誘導(dǎo)的自身免疫性心肌炎小鼠心肌炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中的作用背景促炎細(xì)胞因子的釋放是炎癥反應(yīng)非常重要的調(diào)節(jié)機制,目前已有多篇文獻(xiàn)報道IL-1p、TNF-α和IFN-γ等促炎因子分泌增加與自身免疫性心肌病的發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān)。趨化因子招募炎癥細(xì)胞浸潤病變部位需要激活PI3K/AKT信號通路,AKT屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是PI3K下游最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。我們前面的研究已經(jīng)證明PI3K藥理學(xué)活性的抑制可以緩解心肌肌凝蛋白重鏈氨基酸片段(MyHC-α)誘導(dǎo)的心肌病理損傷并且可明顯降低小鼠的死亡率,說明了PI3K的激活介導(dǎo)了自身免疫性心肌炎的發(fā)生過程中。但是PI3K是如何調(diào)節(jié)心肌炎的發(fā)生的過程依然不清楚。目的探討PI3K信號通路在肌凝蛋白誘導(dǎo)的自身免疫性心肌炎進(jìn)展過程中對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而揭示P13K介導(dǎo)自身免疫性心肌炎的分子機制。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測空白對照組、EAM組以及EAM+LY294002組小鼠心肌中細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)的CD3+T細(xì)胞的數(shù)目,利用western blotting分析上述各組小鼠心肌內(nèi)PI3K下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白AKT磷酸化水平。取正常小鼠心臟旁淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng),分空白對照組,EAM組、EAM+低濃度LY294002組以及EAM+高濃度LY294002組,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測上述各組淋巴細(xì)胞中CD4+和CD8+T細(xì)胞的絕對值及二者的比例。采用ELISA的技術(shù)分別檢測各組小鼠血清中及各組培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞釋放的TNF-α、IL-1β和IFN-γ等炎癥因子。結(jié)果通過免疫組化檢測結(jié)果我們觀察到在EAM小鼠心臟組織切片CD3染色呈強陽性,而在空白組和EAM+LY294002組,CD3染色不明顯。流式細(xì)胞術(shù)顯示,肌凝蛋白的應(yīng)用使得CD4+和CD8+T細(xì)胞的絕對值分別較空白對照組增加(24.3% vs23.22%和11.95% vs 9.36%)。而應(yīng)用1 μM LY預(yù)處理細(xì)胞后,CD4+和CD8+T細(xì)胞的絕對值較EAM組均有所下降(24.05% vs24.3%和7.44% vs 11.95%)；應(yīng)用15μ M LY預(yù)處理細(xì)胞后,CD4+和CD8+T細(xì)胞的絕對值較EAM模型組小鼠有更明顯的下降(21.37% vs24.3%和7.19% vs 11.95%)。肌凝蛋白的應(yīng)用使CD4+/CD8+T細(xì)胞比例較空白對照組降低(2.03 vs 2.48),1 μM和15μ M的LY294002分別使得CD4+/CD8+T細(xì)胞的比例達(dá)到3.23和2.97。western blotting分析結(jié)果顯示小鼠腹腔注射LY294002后,由肌凝蛋白誘導(dǎo)的AKT磷酸化水平下降(0.71±0.12 vs1.14±0.21)。ELISA分析結(jié)果提示,小鼠血清中促炎因子的含量較正常對照小鼠相比,表達(dá)水平明顯升高(TNF-α、IL-1β和IFN-γ3種炎癥因子與對照組相比分別為：174±24.21 vs 48.2±1.52；18.2±1.87 vs 4.07±0.74；220±29.4 vs 40.43±2.34),但是LY294002預(yù)處理小鼠血清中促炎因子的含量升高水平并不明顯(3種炎癥因子與EAM相比分別為：119±4.03 vs 174±24.21；11.5±1.56 vs 18.2±1.87；170±6.43 vs 220±29.4)。細(xì)胞實驗中,培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞受MyHC-α刺激3h后,TNFα、IL-1β和IFN γ等促炎因子的表達(dá)量顯著升高(刺激組3種炎癥因子與對照組相比分別為：78±11.73 vs 19.8±2.23；47.8±5.17 vs 12.3±1.36；92.8±5.27vs 8.23±1.44)。但是如果在加MyHC-α刺激之前,給予細(xì)胞LY294002的預(yù)處理,促炎因子的表達(dá)量依賴性地被抑制了(最大劑量干預(yù)組3種炎癥因子與單獨刺激相比分別為：30±1.78 vs 78±11.73；17.6±1.46 vs 47.8±5.17；22±1.77 vs92.8±5.27)。結(jié)論抑制PI3K可以明顯改善嚙齒類動物心肌肌凝蛋白誘導(dǎo)的小鼠實驗性自身免疫性心肌組織中的炎癥反應(yīng)以及適應(yīng)性免疫細(xì)胞的比例失衡,說明PI3K有可能是通過促進(jìn)心肌炎中的炎癥反應(yīng)以及免疫反應(yīng)進(jìn)在實驗性自身免疫性心肌炎的心肌損傷中發(fā)揮作用。第四部分PI3K在肌凝蛋白誘導(dǎo)的小鼠自身免疫性心肌炎心肌細(xì)胞凋亡中的作用背景有研究表明心肌細(xì)胞的凋亡在心肌炎的病理進(jìn)程中發(fā)揮了獨立的作用。Bax、Bim和Bcl-2同屬于Bcl-2蛋白家族成員,而Bax和Bim主要發(fā)揮促凋亡的作用,而Bcl-2發(fā)揮的是抗凋亡的作用。Bax很久之前就已經(jīng)被證實可以被Bim直接激活,觸發(fā)細(xì)胞色素C的釋放,促進(jìn)caspase瀑布級聯(lián)反應(yīng)的激活,誘發(fā)細(xì)胞的凋亡.caspase屬于半胱氨酸蛋白酶家族,其中caspase-3是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的執(zhí)行蛋白質(zhì),而caspase-9是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的啟動蛋白.我們前面的研究表明PI3K通過促進(jìn)心肌炎中的炎癥反應(yīng)以及免疫反應(yīng)進(jìn)在實驗性自身免疫性心肌炎的心肌損傷中發(fā)揮作用,但是P13K/AKT/mTOR細(xì)胞通路是否參與自身免疫性心肌炎的心肌細(xì)胞凋亡過程并未研究明了。目的在抑制PI3K后,觀察自身免疫性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡的情況,進(jìn)而探討PI3K信號通路對肌凝蛋白誘導(dǎo)的小鼠自身免疫性心肌炎發(fā)病過程中心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。方法利用western blotting的技術(shù)檢測空白對照組、EAM組、EAM+LY294002組小鼠心臟中P13K/AKT/mTOR信號通路中p85(PI3K亞基)、AKT和mTOR蛋白的磷酸化水平。通過免疫印跡和EMSA技術(shù)檢測三組小鼠心肌細(xì)胞核內(nèi)P65(NFκB亞基)的表達(dá)。利用TUNEL染色,觀察三組小鼠心肌細(xì)胞的凋亡情況,并采用western blotting技術(shù)和RT-PCR技術(shù)分析凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)Bax、Bim、caspase3和Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果小鼠腹腔注射PI3K抑制劑LY294002后,較同型實驗組小鼠,P13K/AKT/ mTOR信號通路的活性明顯下降,NF-κB的活性降低,凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bim、caspase3的mRNA的含量明顯增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA的表達(dá)量被抑制。EAM+LY294002組與EAM組相比,P13K/AKT/mTOR信號通路的活性明顯下降(p85、AKT和mTOR蛋白3種指標(biāo)磷酸化水平分別為：3.7±0.23 vs 6.2±0.18；2.18±3.50 vs 5.93±1.26；0.69±0.18 vs 2.32±0.34)。心肌細(xì)胞核蛋白質(zhì)western blotting和EMSA的結(jié)果顯示,LY294002+EAM組與EAM組相比NF-κB的活性降低超過55%(核P65水平分別為：0.42±0.10 vs 1.2±0.16)。TUNEL技術(shù)顯示,LY294002+EAM組與EAM組相比,心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目激增。western blotting技術(shù)分析顯示,LY294002+EAM組與EAM組相比,小鼠心肌中的Bax、Bim、caspase3和Bcl-2的表達(dá)量分別為：2.1±0.20 vs 1.25±0.24；2.2±0.05 vs 0.7±0.06；1.9±0.29vs 1.25±0.20；0.30±0.03 vs 0.92±0.21。RT-PCR的結(jié)果顯示：LY294002+EAM組與EAM組相比,Bax、Bim、caspase3和Bcl-2 mRNA的表達(dá)量分別為：1.0±0.21vs 0.56±0.01；1.75±0.27 vs 0.8±0.22；2.4±0.26 vs 1.2±0.01；0.6±0.21 vs0.9±0.09。結(jié)論抑制PI3K通路可以增加促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),并抑制抗凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),最終可以促進(jìn)亞急性和慢性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞的凋亡。表明PI3K通路在EAM小鼠心肌細(xì)胞的凋亡中起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。
【圖文】：

逡逑圖１．１Ａ：實驗組、低濃度ＥＡＭ組、中濃度ＥＡＭ組、高濃度ＥＡＭ組小鼠的生存曲逡逑線，肌凝蛋白濃度越高，小鼠死亡率越高Ｂ：實驗組、低濃度ＥＡＭ組、中濃度ＥＡＭ逡逑組、高濃度ＥＡＭ組小鼠屯、肌質(zhì)量／體重隨肌凝蛋白濃度增高而增大逡逑■灥逡逑圖１．２：ＨＥ染色檢測Ａ（正常對照組），Ｂ（低濃度ＥＡＭ組），Ｃ忡濃度ＥＡＭ組），Ｄ（高濃逡逑度ＥＡＭ組）的病理形態(tài)（Ｘ２００）逡逑討論逡逑多種因素能導(dǎo)致也肌炎的產(chǎn)生，包括感染性和非感染性劑，，如病毒，細(xì)茵，逡逑原生動物，真菌，毒素Ｗ。屯、肌炎的臨床表現(xiàn)Ｗ及病理改變是多種多樣的，這造成逡逑了屯、肌炎的臨床研究非常困難，由于這些因素引起的臨床癥狀的多樣性，屯、肌炎逡逑的診斷仍然是具有挑戰(zhàn)性的ｔｗｉ。屯、肌炎可Ｗ通過組織學(xué)，免疫學(xué)，免疫姐織化學(xué)逡逑的手段來診斷。但要確定屯、肌炎，需進(jìn)行必內(nèi)膜屯、肌活檢（ＥＭＢ）和分子生物學(xué)逡逑技術(shù)

圖２．１邋ＬＹ２９４００２在小鼠體內(nèi)的毒理學(xué)分析。逡逑ＢＡＬＢ／ｃ小鼠連續(xù)四周每天注射ＬＹ２９４００２邋（濃度４０山體積１０叫），然分離小鼠也臟、肝臟、腎臟和肺進(jìn)行ＨＥ染色，１００倍鏡下觀察四種組織的病理變化。每個實驗結(jié)果進(jìn)行Ｈ次獨立實驗。逡逑二、ＬＹ２９４００２在自身免疫性心肌炎中的治療作用逡逑ｌ．ＭｙＨＣ－ａ誘導(dǎo)實驗性自身性心肌炎的作用逡逑小鼠皮下注射曬齒類動物屯、肌肌凝蛋白重鏈氨基酸片段（ＭｙＨＣ－ａ）和弗氏劑（ＣＦＡ）的混合乳是誘導(dǎo)小鼠實驗性自身免疫性也肌炎的經(jīng)典方法。我們采用逡逑雙次免疫的方法，在初次免疫后４周觀察小鼠罹患屯、肌炎的情況。結(jié)果顯示，皮注射ＭｙＨＣ－ａ４周后可見發(fā)病率極高的小鼠嚴(yán)重的屯、肌炎（表２．１）。小鼠屯、臟質(zhì)／體積比的增加提示小鼠屯、肌病的發(fā)生，在ＭｙＨＣ－ａ誘導(dǎo)的小鼠也肌炎中，我們檢測逡逑至ＩＪ，小鼠的有較重的也、肌病發(fā)生，但是ＬＹ２９４００２的使用可Ｗ改善這種現(xiàn)象（表２．１）。逡逑
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R542.21

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 白洪波;王昀;張玉華;張園;;腺苷酸活化蛋白激酶活化對單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附的影響及其機制[J];生理學(xué)報;2016年01期

2 Dorota Cibor;Renata Domagala-Rodacka;Tomasz Rodacki;Artur Jurczyszyn;Tomasz Mach;Danuta Owczarek;;Endothelial dysfunction in inflammatory bowel diseases: Pathogenesis, assessment and implications[J];World Journal of Gastroenterology;2016年03期

3 李萌;呂仕超;吳美芳;張軍平;;實驗性自身免疫性心肌炎動物模型的建立與評價[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2013年02期

本文編號：2579200