【摘要】：心力衰竭（HeartFailure，HF）是各種危重心血管疾病發(fā)展的終末階段，HF確診患者5年生存率僅為50%，被認(rèn)為是危害人類健康的主要疾病之一。近年來國內(nèi)外研究者普遍認(rèn)為，HF的本質(zhì)是一種分子-臨床綜合征，基因表達(dá)調(diào)控異常與HF的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。microRNA（miRNA）是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼內(nèi)源性小單鏈RNA分子，主要作用是通過誘導(dǎo)靶基因沉默參與轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控。特定miRNA的表達(dá)模式很大程度上取決于組織和細(xì)胞類型、代謝情況以及疾病狀態(tài)。表觀遺傳學(xué)資料表明，miRNA參與HF的多個基本病理過程，如心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化、心肌肥厚和心臟重構(gòu)等。由于標(biāo)準(zhǔn)化程序缺乏、病例數(shù)少以及不同病例間變異程度高等原因，人類衰竭心臟miRNA的研究在很大程度上受到限制。雖然如此，有研究者比較了人類與模型動物衰竭心臟miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)多數(shù)miRNA的表達(dá)模式呈現(xiàn)較好的一致性。因此，通過實驗動物模擬不同病因的HF并進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析，可以為miRNA在人類心衰發(fā)病機(jī)制中的研究提供有價值的參考。本研究采用結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支的方法構(gòu)建心肌梗死后HF模型，通過 Solexa高通量測序技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)分別檢測模型組及對照組左室心肌組織miRNA表達(dá)譜，分析模型組與對照組已知miRNA的表達(dá)差異并預(yù)測出新的miRNA。之后利用RNAhybrid軟件預(yù)測差異表達(dá)miRNA的靶基因，并通過對差異miRNA的候選靶基因進(jìn)行GO注釋和KEGG通路分析，初步了解候選靶基因行使的主要生物學(xué)功能及參與的主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。此后，我們采用與測序相同的大鼠心肌樣本進(jìn)行實時熒光定量PCR驗證miRNA測序的可靠性，并分別檢測部分差異miRNAs（miR-31a-5p，199a-5p，122-5p和208a-3p）在術(shù)后4周、8周、10周心肌組織中的表達(dá)變化，了解差異miRNA在心梗術(shù)后不同時期的動態(tài)表達(dá)模式及其對心衰發(fā)展的可能作用。最后，我們通過化學(xué)合成的miRNAmimics和inhibitor改變心肌細(xì)胞內(nèi)miR-31a-5p及miR-199a-5p的表達(dá)水平，初步探究miR-31a-5p及miR-199a-5p對AngII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用。 結(jié)果： 1.采用開胸結(jié)扎冠狀動脈前降支的方法成功誘導(dǎo)大鼠心肌梗死，通過對術(shù)后4周、8周、10周大鼠超聲心動圖、心臟肥厚指數(shù)、BNP及心肌病理形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)后隨時間進(jìn)展，模型組大鼠心功能進(jìn)行性下降，不良心臟重構(gòu)逐漸加重，心梗后10周已形成穩(wěn)定心衰。 2.通過高通量測序成功構(gòu)建對照組與心衰組左室心肌組織miRNA表達(dá)譜，共鑒定225種已知miRNAs，其中107種miRNAs表達(dá)水平在兩組有明顯差異，與對照組相比，79種miRNAs顯著上調(diào)，28種miRNAs顯著下調(diào)；兩組表達(dá)量差異在2倍以上的miRNAs共有18種，其中16種表達(dá)量在心衰組顯著上調(diào)，2種表達(dá)量在心衰組顯著下調(diào)。 3.采用RNAhybrid軟件對18個差異顯著miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測，共得到31401個候選靶基因，針對這些預(yù)測靶基因進(jìn)行GO及KEGG分析，并與參考基因組進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，差異miRNA的候選靶基因主要在信號通路、細(xì)胞通訊、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞表面受體及細(xì)胞表面調(diào)控等GO條目顯著富集，并鑒定出包括Wnt信號通路、VEGF信號途徑、MAPK信號途徑、細(xì)胞周期、II型糖尿病、Notch信號途徑、血管平滑肌收縮等與心衰相關(guān)通路在內(nèi)的36個顯著富集的KEGG信號通路。 4.實時熒光定量PCR結(jié)果與測序結(jié)果一致，證實測序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。 5.心梗術(shù)后4周、8周、10周分別檢測特定miRNA的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，特定miRNA在心梗后心衰發(fā)展過程中呈現(xiàn)時間-依賴的表達(dá)模式：miR-199a-5p和miR-31a-5p在心梗術(shù)后隨時間進(jìn)展表達(dá)水平逐漸升高，提示其可能參與心衰的發(fā)病過程；miR-122-5p在心梗術(shù)后早期階段表達(dá)水平無顯著變化，但在形成穩(wěn)定心衰后表達(dá)水平顯著升高，提示miR-122-5p可能作為心衰潛在的生物標(biāo)志物；而miR-208a-3p在心梗的早期階段表達(dá)水平顯著升高，之后逐漸下降，至術(shù)后8周時與對照組無明顯差異，之后其表達(dá)仍繼續(xù)下降，至術(shù)后10周時心衰組其表達(dá)水平顯著低于對照組。這些數(shù)據(jù)表明特定miRNA很可能在心衰發(fā)展的不同時期發(fā)揮不同作用。 6.100nM的AngII作用于心肌細(xì)胞能夠成功誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡；通過在AngII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡模型中過表達(dá)或抑制miR-199a-5p的水平發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p不僅能顯著增加AngII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，單獨(dú)作用也能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，與之不同的是，miR-31a-5p僅能輕微增加AngII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，，單獨(dú)作用對心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生也無明顯影響。 結(jié)論： 1.本研究共篩選出107種表達(dá)水平有明顯差異的miRNAs，其中兩組表達(dá)量差異在2倍以上的miRNAs有18種，為miRNA在心衰發(fā)病機(jī)制中的研究提供了依據(jù)； 2.明確了miR-31a-5p，199a-5p，122-5p及208a-3p在心梗后不同時期的動態(tài)表達(dá)模式，表明特定miRNA在心衰發(fā)展的不同時期其作用可能不同； 3.miR-199a-5p能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生，抑制其表達(dá)有可能成為防止AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的有效方法。
【圖文】：

于 70 歲 人 群 中 有 超 過 10 % 的 發(fā) 病 率[1 2] ， 此 外 ， 心 衰 確 診 患 者 5 年 生 5 0% ，而 且 近 10 年來 心 衰的 發(fā) 病率 繼 續(xù)升 高 [1 3] ，這 為 全球 帶 來了 沉 重社 會 負(fù)擔(dān) 。 因 此 ，各 國 的 研究 者 一 直著 眼 于 尋 求有 效 的 心衰 防 治 措 施 發(fā) 病 機(jī) 制 也 有 了 更 加 深 入 的 認(rèn) 識 ： 從 20 世 紀(jì) 40 ~ 6 0 年 代 的 心 腎 學(xué)0 年代 的 血 流動 力 學(xué) 學(xué) 說 ，再 到 心循 環(huán) 學(xué)說 以及 90 年 代以 來 的 心 臟重 而 為 針對 其 發(fā) 病機(jī) 制 給 予 更有 效 的 防治 措 施 提 供了 理 論 依據(jù) 。 從本 質(zhì) 衰 竭 是 一 種 分 子- 臨 床 綜 合 癥 ， 心 衰 的 發(fā) 生 與 心 臟 的 功 能 、 神 經(jīng) 激 素 分異 常 相關(guān) ， 并伴 隨結(jié) 構(gòu) 和 形 態(tài)學(xué) 改 變 。心肌 的 初 始損 傷 可 能是 急 性 或 慢一 系 列由 包 括 心 肌細(xì) 胞 、 心 肌 成 纖 維細(xì) 胞 和 細(xì) 胞外 基 質(zhì) 參與 、 通 過 一系 細(xì) 胞 和 分 子 途 徑 激 活 的 初 始 代 償 機(jī) 制 產(chǎn) 生 ， 此 時 如 果 不 給 予 適 當(dāng) 干 預(yù)就 會 發(fā)生 不 良 重 構(gòu) ，并 最 終不 斷 惡 化發(fā) 展 為 心 衰 。心 衰 的發(fā) 生 進(jìn) 展 與心 本 病 理過 程 直 接 相關(guān) ： 不 良心 室 重 構(gòu)、 心 肌 細(xì) 胞肥 大 、 心 肌 細(xì) 胞 凋亡 和 圖 1[1 4] ），這 些 過程 緊 密相 連 并 交織 在 一起 共 同 導(dǎo)致 心 衰的 不 斷 惡化 。

疫 - 炎 癥 通 路 和 細(xì) 胞 活 動 ， 促 進(jìn) 梗 死 傷 口 愈 合 及 左 室 結(jié) 構(gòu) 性 重 構(gòu) ， 這 些 病 理及 炎 癥活 動 不 僅存 在 于梗 死 區(qū)域 ，也 存在 于 其余 存 活 心肌 中[1 5 -1 7 ] �；� 復(fù) 階段 室重 構(gòu) 包 括 梗 死心 肌壁 的 變 薄和 擴(kuò) 張 （梗 死 擴(kuò) 張 ）； 在晚 期階 段 ， 左 室重 構(gòu) 于 存 活 心肌 的 結(jié) 構(gòu)重 排 ， 這涉 及 心 肌細(xì) 胞 肥 大、 間 質(zhì) 纖維 化 及 左室 擴(kuò) 大 [1 8, 1心臟 在 心肌 缺 血 后的 愈 合及 修 復(fù)是 一 個 連續(xù) 和 重疊 的 復(fù) 雜過 程 [1 5 -1 7 , 2 0] ，該始 于 壞 死心 肌 被 肉 芽組 織 替 代的 炎 癥 階段 ，接下 來是 纖 維 發(fā)生 階 段 并 伴隨 瘢 織 生 成 。梗 死 區(qū) 的 愈合 依 賴 快速 嚴(yán) 格 的髓 樣 細(xì) 胞 招募 ， 特 別是 單 核 細(xì) 胞的 協(xié) 化 ， 這 促進(jìn) 細(xì) 胞 廢 墟和 凋 亡 細(xì)胞 的 再 吸收 、 細(xì) 胞 外基 質(zhì) 組 分的 降 解 、肉 芽 組 成 的 調(diào) 節(jié)以 及 新 生 血管 發(fā) 生 ，這 些 病 理過 程 是 通 過細(xì) 胞 因 子、 蛋 白 酶 及生 長 的 分 泌 實 現(xiàn) 的[ 2 0- 2 4] （ 圖 2[2 5 ]）。 盡 管 從 動 物 模 型 中 能 夠 了 解 心 肌 梗 死 后 恢 復(fù)細(xì) 胞 組 分隨 時 間 在 心肌 組 織 中的 變 化 情況 ， 但是 至今 我 們 僅部 分 了 解 梗死 區(qū) 死 邊 緣 區(qū)高 度 復(fù) 雜 的病 理 過 程 ，這里 不 同亞 型 的 侵 入性 髓 樣 細(xì)胞 以 時 間依 賴 式 與 原位 組織 相 互作 用， 并 刺激 傷 口的 愈 合 。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R541.6;R542.22

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 朱文暉;張曉紅;肖淵茗;;超聲心動圖評價心力衰竭大鼠模型心功能改變[J];中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2009年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 滕宇;小鼠精原細(xì)胞與精母細(xì)胞miRNA差異表達(dá)及功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

2 張忱;大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬miRNA表達(dá)譜的研究[D];中南大學(xué);2010年

本文編號：2575559