【摘要】：心血管疾病是威脅人類健康的重要因素之一。目前,心血管疾病已經(jīng)超越腫瘤等慢性非傳染性疾病,成為全世界死亡率最高的疾病,其死亡率達(dá)到了31%。盡管針對治療和預(yù)防心血管疾病的研究和投入是所有慢性非傳染性疾病中最昂貴的,其發(fā)病率和死亡率仍然每年在增長,提示其他重要發(fā)病因素的存在。大量臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,孕期暴露于營養(yǎng)不良、缺氧等不利環(huán)境,會導(dǎo)致子代成年對心血管疾病的危險(xiǎn)因素敏感性增高,從而更容易罹患心血管疾病,甚至誘發(fā)嚴(yán)重的心血管事件。我室在利用脂多糖和酵母多糖成功構(gòu)建子代成年大鼠高血壓模型的基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)孕中期接受脂多糖刺激,與正常組相比,其子代大鼠成年后隨年齡增長逐漸出現(xiàn)心肌纖維化和心肌重構(gòu),并導(dǎo)致舒張功能下降,這種心肌重構(gòu)和舒張功能的下降可能與心臟NF-κB通路和心臟局部RAAS異常激活有關(guān),但具體機(jī)制及其對子代成年心血管疾病易感性的影響仍不明確。目前,對于心臟疾病易感性的起因和機(jī)制研究主要集中在成年個(gè)體,因此,本研究結(jié)果可能擴(kuò)大心臟疾病預(yù)防和治療的時(shí)間窗,將防治心臟疾病的時(shí)間追溯到了生命早期。方法:1.孕鼠處理方案:SD孕鼠隨機(jī)分為兩個(gè)組(每組9-10只):對照組、LPS組。LPS組孕鼠分別在孕第8、10、12天給予腹腔注射LPS 0.79mg/kg,對照組孕鼠給予腹腔注射生理鹽水。子代大鼠三周齡斷奶,正常飼養(yǎng)至出生后第20周。2.子代大鼠處理方案:對照組和LPS組的子代大鼠20周齡時(shí),分別隨機(jī)分為4組(每組6只):LPS組子代大鼠分別給予皮下注射生理鹽水,異丙腎上腺素(ISO)5mg/kg/day,皮下注射ISO+腹腔注射SB202190 0.4mg/kg/day,皮下注射ISO+口服NAC2.5mg/kg/day,分別定義為LPS+Ve、LPS+ISO、LPS+ISO+SB202190和LPS+ISO+NAC組,對照組子代大鼠采取與LPS組子代大鼠一致的處理方式,定義為Con+Ve、Con+ISO、Con+ISO+SB202190和Con+ISO+NAC組,刺激時(shí)間為兩周。ISO急性刺激實(shí)驗(yàn)中,對照組和LPS組的子代大鼠20周齡時(shí),分別隨機(jī)分為2組(每組6只),一次性分別給予皮下注射生理鹽水和ISO(5mg/kg)。3.高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)評價(jià)子代大鼠心臟功能和心臟血流動(dòng)力學(xué)。4.he染色法評價(jià)子代大鼠心肌細(xì)胞總體形態(tài)、心肌細(xì)胞大小;masson三色染色法評價(jià)心肌纖維化和膠原沉積。5.冰凍組織切片dhe熒光染色評價(jià)子代大鼠心臟活性氧簇表達(dá)。6.real-timepcr檢測子代大鼠心臟左室組織中活性氧產(chǎn)生和清除相關(guān)基因(nox2、nox4、sod1、sod2)的mrna表達(dá)情況和心肌肥厚和纖維化相關(guān)基因(α-mhc、β-mhc、anp、bnp、col1a1、col3a1、mmp2、mmp9)的mrna表達(dá)。7.westernblot法檢測子代大鼠心臟組織中p38、jnkmapk信號通路蛋白表達(dá)以及α-mhc、β-mhc等心肌重構(gòu)相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.孕期炎癥刺激對子代成年大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響1.1與對照組子代大鼠相比,孕期炎癥刺激子代大鼠左室室間隔厚度(ivst)顯著增加、收縮末期左室內(nèi)徑(lvids)顯著降低(p0.05),左室中膠原容積分?jǐn)?shù)(cfv%)、主要的膠原類型col1a1和及其降解酶mmp9表達(dá)增加(p0.05),表明孕期炎癥刺激子代大鼠存在明顯的心肌重構(gòu)。1.2與對照組子代大鼠相比,lps孕期炎癥刺激子代大鼠心臟左室射血分?jǐn)?shù)(lvef%)、左室短軸縮短率(lvfs%)顯著升高(p0.05),說明孕期炎癥刺激子代大鼠存在明顯心臟功能改變。2.孕期炎癥刺激子代大鼠對iso刺激心臟損傷敏感性增加2.1iso刺激兩周,正常對照組子代大鼠心臟重量指數(shù)(hmi)和左心室重量指數(shù)(lvmi)明顯增加(p0.001),但相同刺激下,孕期炎癥刺激子代大鼠hwi和lvmi顯著增加(p0.001),且增加幅度明顯高于相同處理的對照組子代大鼠(p0.001)。2.2iso刺激兩周,正常對照組子代大鼠左室與心肌肥厚相關(guān)的胚胎基因β-mhc表達(dá)降低(p0.05)、anp表達(dá)增加(p0.01)、bnp和非胚胎基因α-mhc表達(dá)無顯著差異(p0.05),α-mhc/β-mhc表達(dá)顯著升高(p0.01)。而孕期炎癥刺激子代大鼠左室與心肌肥厚相關(guān)的胚胎基因β-mhc、anp、bnp表達(dá)顯著增加(p0.01);與正常對照組子代大鼠不同的是,非胚胎基因α-mhc表達(dá)顯著降低(p0.01),α-mhc/β-mhc差異無論在mrna水平和蛋白水平都顯著降低(p0.01),且低于相同處理的對照組子代大鼠(p0.05)。這說明孕期炎癥刺激子代大鼠對iso誘導(dǎo)的心肌肥厚敏感性增加。2.3iso刺激兩周,正常對照組子代大鼠膠原容積分?jǐn)?shù)(cvf%)、左室中主要存在的膠原類型col1a1、col3a1及其降解酶mmp2表達(dá)顯著增加(p0.01);相同刺激條件下,孕期炎癥刺激子代大鼠膠原容積分?jǐn)?shù)(cvf%)、左室中主要存在的膠原類型col1a1、col3a1及其降解酶mmp2表達(dá)也顯著增加(p0.01),且增加幅度高于相同處理的對照組子代大鼠(p0.05)。說明孕期炎癥刺激子代大鼠對iso誘導(dǎo)的心肌纖維化敏感性增加。2.4iso刺激兩周,正常對照組子代大鼠心臟收縮功能指標(biāo)左室短軸縮短率(lvef%)、左室射血分?jǐn)?shù)(lvfs%)無顯著改變(p0.05)。與此相反,相同刺激條件下,孕期炎癥刺激子代大鼠lvef%、lvfs%顯著降低(p0.001),lvef%、lvfs%分別降低13%和22%。提示iso刺激條件下,孕期炎癥刺激子代大鼠心臟收縮功能顯著降低。3.孕期炎癥刺激導(dǎo)致子代大鼠對iso誘導(dǎo)的心臟損傷敏感性增加的機(jī)制研究3.1活性氧產(chǎn)生與清除失衡介導(dǎo)的孕期炎癥刺激子代大鼠對iso誘導(dǎo)心臟損傷敏感性增加。3.1.1沒有iso刺激的情況下,通過超氧化物陰離子水平熒光探針dhe染色顯示,與對照組子代大鼠相比,孕期炎癥刺激子代大鼠心臟組織dhe熒光染色強(qiáng)度有增加趨勢,但無顯著差異。iso連續(xù)刺激兩周,對照組子代大鼠心臟中dhe染色熒光強(qiáng)度顯著增加(p0.01),孕期炎癥刺激子代大鼠心臟中dhe染色熒光強(qiáng)度也顯著增加(p0.001),且顯著高于相同處理的對照組子代大鼠(p0.001)。3.1.2與正常對照組子代大鼠相比,孕期炎癥刺激子代大鼠左室中促進(jìn)ros生成的nadph氧化酶(如nox2、p47phox)mrna表達(dá)顯著增加(p0.05),nox2在蛋白水平表達(dá)也有增加趨勢,說明孕期炎癥刺激子代大鼠存在ros激活。iso刺激兩周后,對照組子代大鼠左室中促進(jìn)ros生成的nadph氧化酶(如nox2、p67phox)mrna表達(dá)顯著增加(p0.01),nox4和p22phoxmrna表達(dá)也有增加趨勢,但無顯著差異;相同刺激條件下,孕期炎癥刺激子代大鼠左室中促進(jìn)ros生成的nadph氧化酶(如nox2、p67phox、nox4和p22phox)mrna表達(dá)也顯著增加(p0.01),且顯著高于相同刺激的對照組子代大鼠(p0.05or0.01)。nox2在蛋白水平的表達(dá)趨勢與mrna水平一致。3.1.3與正常對照組子代大鼠相比,孕期炎癥刺激子代大鼠左室中促進(jìn)ros清除的sod1、sod2、sod3、catalasemrna表達(dá)顯著增加(p0.05or0.01),sod1蛋白表達(dá)水平也顯著增加(p0.05)。iso刺激兩周后,對照組子代大鼠左室中促進(jìn)ros清除的sod1、sod2、sod3、catalasemrna表達(dá)顯著降低(p0.05or0.01),而孕期炎癥刺激子代大鼠左室中促進(jìn)ros清除的sod1、sod2、sod3、catalase和gpx-1mrna表達(dá)也顯著降低(p0.01or0.001),且低于相同刺激對照組子代大鼠的趨勢,但無顯著差異。sod1和sod2蛋白表達(dá)水平與mrna水平一致。3.1.4抗氧化劑nac能降低iso導(dǎo)致的孕期炎癥刺激子代大鼠心肌纖維化,提高心肌收縮能力。3.2p38mapk激活介導(dǎo)的孕期炎癥刺激子代大鼠對iso誘導(dǎo)心臟損傷敏感性增加。3.2.1與正常對照組子代大鼠相比,孕期炎癥刺激子代大鼠左心室p-p38表達(dá)顯著增加(p0.05),說明孕期炎癥刺激子代大鼠左室中p38mapk被激活。3.2.2無論是否用iso刺激,孕期炎癥刺激子代大鼠左室p-p38表達(dá)比相同刺激的正常對照組子代大鼠顯著增加(p0.05)。iso刺激兩周后,正常對照組和孕期炎癥刺激子代大鼠左室中p-p38表達(dá)都無顯著改變(p0.05)。3.2.3考慮到p38激酶激活的周期性特性,我們進(jìn)行了iso急性刺激實(shí)驗(yàn)。在iso急性刺激實(shí)驗(yàn)中,對照組子代大鼠左室p-p38表達(dá)顯著升高(p0.05),孕期炎癥刺激子代大鼠左室p-p38表達(dá)顯著升高(p0.01),且比相同處理的對照組子代大鼠升高更明顯(p0.01)。3.2.4p38活性抑制劑sb202190能降低iso導(dǎo)致的孕期炎癥刺激子代大鼠心肌肥厚、心肌纖維化,提高心肌收縮能力。3.3ros與p38mapk相互作用放大了孕期炎癥刺激子代大鼠對iso誘導(dǎo)的心臟損傷作用3.3.1抗氧化劑nac能降低孕期炎癥刺激子代大鼠iso刺激組左心室中p-p38表達(dá)(p0.05)。3.3.2p38活性抑制劑sb202190降低孕期炎癥刺激子代大鼠iso刺激組左室中與ros生成有關(guān)的nadph氧化酶nox2、p67phox、p22phoxmrna水平表達(dá)(p0.01),提示ros和p38mapk并不是簡單的上下游通路關(guān)系,可能通過ros-p38mapk相互作用,共同促進(jìn)iso刺激條件下,孕期炎癥刺激子代大鼠的心臟損傷。結(jié)論:1.孕期炎癥刺激導(dǎo)致子代成年大鼠對iso誘導(dǎo)的心肌損傷敏感性增加,主要表現(xiàn)為左心室肥厚,心肌纖維化程度加重,左室收縮功能顯著降低。2.活性氧生成與清除失衡是導(dǎo)致孕期炎癥刺激子代成年大鼠對ISO誘導(dǎo)的心肌損傷敏感性增加的機(jī)制之一,抗氧化劑NAC降低ISO誘導(dǎo)孕期炎癥刺激子代成年大鼠的心肌纖維化損傷程度,提高心臟收縮功能。3.p38 MAPK激活是導(dǎo)致孕期炎癥刺激子代成年大鼠對ISO誘導(dǎo)的心肌損傷敏感性增加的另一可能機(jī)制,p38活性抑制劑SB202190降低ISO誘導(dǎo)的孕期炎癥刺激子代成年大鼠心肌肥厚、心肌纖維化損傷程度,提高心臟收縮功能。4.ROS與p38 MAPK相互作用進(jìn)一步加劇了ISO對孕期炎癥刺激子代大鼠的心臟損傷作用。
【圖文】：

圖 1.1.1 ISO 刺激后心臟重量改變情況，***P< 0.001,###P< 0.0011 ISO treatment increased The index of Heart-to-body weight (HMI=Hs Index (LVMI=LVW/BW) in offspring of control and that of prenially in the latter. HMI, LVMI were determined by HW/BW (mg/g) andSO 刺激對心肌肥厚相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響肥厚的基因主要有 α-MHC，，β-MHC，ANP，BNP。無 ISO心室中 ANP mRNA 水平顯著增加，是對照組子代鼠的 1.60.05）, α-MHC/β-MHC mRNA 水平是對照組子代鼠的 2.3 倍 0.01）。ISO 刺激兩周后，LPS 子代鼠與心肌肥厚相關(guān)基因-MHC，ANP，BNP 基因表達(dá)增加 1.7, 29.0, 3.5 倍，而 α-s. LPS+Ve, P < 0.01），對照組只表現(xiàn)為 ANP 顯著增加

33圖 1.1.3 ISO 刺激后 α-和 β-MHC 蛋白表達(dá)情況*, #P< 0.05,**, ##P< 0.01,***, ###P< 0.001Figure 1.1.3 The protein expressions of α-MHC and β-MHC were determined by immunoblotting inleft ventricle.Representative plots in each group and statistical data of relative densitometry, normalizedby GAPDH, are shown.
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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本文編號：2557888