【摘要】：目的：研究小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞在雄激素的干預(yù)下向新生毛細(xì)血管發(fā)生的作用機(jī)制,明確雄激素調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞的作用靶點(diǎn),為基于內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)心臟缺血性疾病的治療思路提供理論依據(jù)。方法：首先分離、培養(yǎng)骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞,基于內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)體系EBM-2培養(yǎng)后獲取EPCs,采用Dil-ac-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)、以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD31、CD34、CD11b、CD133、CD105、CD45,完成EPCs細(xì)胞鑒定。通過(guò)將EPCs與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)共培養(yǎng)完成體夕matrigel管樣結(jié)構(gòu)結(jié)合實(shí)驗(yàn),分別采用不同濃度梯度(Onmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L)的人工合成雄激素雙氫睪酮(DHT)預(yù)處理EPCs,進(jìn)而根據(jù)管樣結(jié)構(gòu)結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果獲取DHT的最適宜干預(yù)濃度為10 nmol/L。結(jié)合基因芯片技術(shù)、信號(hào)通路分析軟件篩選DHT干預(yù)下的EPCs各基因的表達(dá)差異。采用realtime PCR驗(yàn)證部分篩選出的異常表達(dá)基因,選定Efnb2為目的基因。構(gòu)建shRNA-Enfb2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體體外轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞,realtime PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后EPCs中Efnb2基因的表達(dá)水平。再次行matrigel管樣結(jié)構(gòu)結(jié)合實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)分為四組：①單純EPCs對(duì)照組、②lOnmol/L DHT處理的EPCs組、③10nmol/L DHT+NC-shRNA處理EPCs組、④10nmol/L DHT+Efnb2-shRNA處理EPCs組。通過(guò)評(píng)估管樣結(jié)構(gòu)中熒光標(biāo)記的EPCs數(shù)量評(píng)價(jià)各組EPCs向血管新生的生物學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制。最后基于小鼠下肢缺血模型的建立進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,體內(nèi)研究分為五組：①空白對(duì)照組、②單純EPCs移植組、③lOnmol/L DHT處理的EPCs移植組、④10nmol/L DHT+NC-shRNA處理EPCs移植組、⑤10nmol/L DHT+Efnb2-shRNA處理EPCs移植組。各組動(dòng)物分別于術(shù)后第二天,在股總動(dòng)脈結(jié)扎處兩側(cè)、股深動(dòng)脈結(jié)扎處兩側(cè)及小腿腓腸肌處分別以微量注射針注射25μ1各組EPCs田胞液行干預(yù)治療。下肢缺血手術(shù)后第7天、第14天(即EPCs注射后第5天、第12天)行下肢血流激光多普勒掃描評(píng)估下肢血流灌注水平。術(shù)后第14天處死小鼠,并獲取下肢肌肉組織標(biāo)本,通過(guò)免疫熒光判定EPCs存活量及新生毛細(xì)血管密度。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均采用Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示,多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析,兩兩組間比較采用t檢驗(yàn)方法,以P0.05視為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果：成功從小鼠長(zhǎng)骨骨髓中分離獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞,通過(guò)EBM-2培養(yǎng)基成功培養(yǎng)EPCs,流式細(xì)胞表面抗原檢測(cè)及Dil-ac-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)均提示符合EPCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)。不同DHT濃度梯度干預(yù)EPCs后natrigel管樣結(jié)構(gòu)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示最適宜DHT濃度為10 nmol/L。采用基因芯片檢測(cè)DHT干預(yù)后EPCs基因表達(dá)差異,再結(jié)合realtimePCR驗(yàn)證后初步篩選出11個(gè)異常表達(dá)基因：Egr1、Vcan、Fgf3、Cxcl 10、Cxcl 2、 Hdac4、Bmp7、Stfa211、Cldn1、Cdk2ap1、Efnb2。選取Efnb2為目的基因構(gòu)建Efhb2-shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)EPCs后觀察熒光信號(hào)以及ealtime PCR驗(yàn)證基因抑制水平,提示成功獲取穩(wěn)轉(zhuǎn)的Efnb2-shRNA-EPCs,可用于進(jìn)一步研究。體外研究中經(jīng)DHT預(yù)處理各組EPCs進(jìn)行matrigel管樣結(jié)構(gòu)結(jié)合實(shí)驗(yàn),結(jié)果提示相較單純DHT處理組,同時(shí)經(jīng)Efnb2-shRNA干預(yù)可顯著削弱EPCs血管樣分化的能力,提示Efnb2極有可能是DHT調(diào)控EPCs生物學(xué)行為的重要靶基因位點(diǎn)之一。體內(nèi)研究成功構(gòu)建小鼠下肢缺血模型,在進(jìn)行各組細(xì)胞干預(yù)之后,激光多普勒結(jié)果提示10nmol/LDHT處理的EPCs移植組和10nmol/L DHT+NC-shRNA處理EPCs移植組均可獲得顯著的下肢血運(yùn)重建效果,而攜帶Efnb2-shRNA的EPCs未能表現(xiàn)出理想的血管再生功能。此外lectin熒光染色(提示血管生成)和GFP+(EPCs示蹤)也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì),再次驗(yàn)證了體外研究部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)論：DHT能夠顯著提高內(nèi)皮祖細(xì)胞向血管樣結(jié)構(gòu)的形成能力,其適宜的干預(yù)濃度為10nmol/L,而DHT正性調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)行為可能是通過(guò)靶基因Efnb2的下游信號(hào)通路。維持適宜的DHT濃度以及上調(diào)Efnb2基因表達(dá)水平可顯著提高內(nèi)皮祖細(xì)胞在缺血性疾病中改善血流灌注的療效。本研究為基于內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)缺血性心臟病的治療思路提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

夷光顯微鏡下因ＥＰＣｓ吞隧Ｄｉｌ－ａｃ－ＬＤＬ，貼壁細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含紅色巧光，而逡逑細(xì)胞核染色表現(xiàn)為藍(lán)色焚光，陽(yáng)性染色率近１００％，提示該貼壁細(xì)胞可較好的吞睡逡逑ＤＵ－ａｃ－ＬＤＬ邋（圖２）。逡逑ＢＢｇｇｉｔｊｉｉｏｒＴａＰｉｔｇｉ逡逑媝畫(huà)嫇逡逑圖２．�。茫笸屉SＤｉｌ－ａｃ－ＬＤＬ染色結(jié)果逡逑３．３流式細(xì)胞儀鑒定ＢＭ－ＭＮＣｓ逡逑將獲取的ＢＭ－ＭＮＣｓ通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，細(xì)胞表面抗原表達(dá)為ＣＤ１３３邋（９３．３逡逑±邋１．４％）、ＣＤ１０５邋（９１．１邋±邋１．３0／0）、ＣＤ４５邋（％．１邋±邋０．２0／0）、ＣＤ１邋化（６２．１邋±逡逑６．５％）、ＣＤ３１邋（１４．５邋±邋１．４0／0）、ＣＤ３４邋（５．６邋±邋１．２％）。提示經(jīng)培養(yǎng)誘導(dǎo)分化獲取的逡逑細(xì)胞群符合普遍認(rèn)為的ＥＰＣｓ特征，可應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖３）。逡逑１６逡逑

圖１．倒置顯微鏡觀察ＥＰＣｓ形態(tài)逡逑３．２邋Ｄｉｌ－ａｃ－ＬＤＬ吞y笛殄義弦墓庀暈⒕迪亂潁牛校茫笸趟恚模椋歟幔悖蹋模蹋諳赴南赴誓諍焐曬�，，而辶x

本文編號(hào)：2531500