發(fā)布時間：2019-08-13 18:04

【摘要】：心肌梗死(myocardial infarction, MI)是臨床上常見的危重病癥,我國流行病學(xué)資料顯示,近年我國心肌梗死發(fā)病率和病死率急劇升高、且呈年輕化趨勢¨。MI可致多種心律失常發(fā)生,梗死后惡性室性心律失常是MI最主要的死亡原因。國外流行病學(xué)調(diào)查顯示,心臟性猝死75%為心梗后心律失常性猝死。因此正確評估和處理梗死后室性心律失常,對提高患者的生存率和生活質(zhì)量有重要意義。MI后隨著時間的延長,缺血心肌發(fā)生壞死、肥厚和纖維化改變,導(dǎo)致心室擴張、張力增加,室壁運動異常。研究顯示,MI后的這種病理性重構(gòu)在梗死后一年內(nèi)持續(xù)存在并不斷進展,使心臟收縮和舒張功能逐漸減弱、并可導(dǎo)致惡性心律失常的發(fā)生。因此在MI后早期有效的干預(yù)心室重構(gòu),減輕心肌纖維化,將有助于提高心臟功能和減少心律失常的發(fā)生。心臟微血管是心肌組織進行物質(zhì)交換、能量代謝以及信息調(diào)控的主要場所,MI后微循環(huán)功能障礙在心臟重塑中占有重要作用。近年,越來越多的臨床證據(jù)表明,在具有冠心病風(fēng)險患者的早期階段,心臟微循環(huán)可能已經(jīng)發(fā)生變化,其病理改變可能是梗死患者中期并發(fā)癥發(fā)病率和死亡率增加的原因。目前,隨著經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention, PCI)及冠脈搭橋手術(shù)(coronary artery bypass grafting, CABG)水平的提高,AMI患者大血管再通率和存活率有所提高,然而術(shù)后心肌無復(fù)流現(xiàn)象卻時常發(fā)生,研究表明心臟微循環(huán)功能障礙是主要原因。因此,臨床上也有研究把微循環(huán)功能作為預(yù)測心�；颊唛L期高質(zhì)量存活的一個指標MI/缺血后若能有效改善微循環(huán)狀態(tài)將有助于顯著提高心臟功能并逆轉(zhuǎn)或延緩心肌重構(gòu)。目前藥物治療仍是防治MI后心律失常發(fā)生的主要手段,臨床上常規(guī)的藥物療法主要包括鈉通道阻滯劑、β受體阻滯劑、鉀通道阻滯劑、鈣通道阻滯劑和洋地黃類[13]。然而,這些藥物中很多最初被認為很有前途的抗心律失常藥物在應(yīng)用中被發(fā)現(xiàn)是增加而不是減少MI患者的死亡率。循證學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在MI病人康復(fù)期,部分離子通道阻滯劑有致心律失常效應(yīng),甚至增加死亡率。僅β受體阻滯劑較為安全,但因其負性心率和負性肌力作用使其應(yīng)用受限�？梢娔壳皢我弧白铚c對抗”模式的心律失常藥物干預(yù)難以起到對心梗后心律失常的良好治療作用[18]。我們也由此推測,一種理想的治療心梗后心律失常藥物應(yīng)具備多層面抗心律失常有效性且長期應(yīng)用安全性的效用。參松養(yǎng)心(Shensong Yangxin capsules, SSYX)是由丹參、黃連、桑寄生、甘松、龍骨、山茱萸、人參、五味子、赤芍、酸棗仁、麥冬、土鱉蟲12種中藥成分組成的復(fù)方中成藥物[19]。該藥物組方的配方原理是基于中醫(yī)“承制調(diào)平”的脈絡(luò)學(xué)說及通絡(luò)理論,不同藥物成分之間具有互補作用參松養(yǎng)心己獲中國國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA) (2003年,文件號Z20030058)批準,應(yīng)用于臨床治療心律失�！�。動物實驗發(fā)現(xiàn),參松養(yǎng)心能明顯抑制藥物誘發(fā)的心律失常和缺血再灌注損傷誘發(fā)的心律失常。多中心臨床研究表明,參松養(yǎng)心可有治療器質(zhì)性、非器質(zhì)性室性早搏。臨床隨機對照研究顯示,參松養(yǎng)心對室性早搏、陣發(fā)性房顫的治療與西藥療效相當(dāng),且對相應(yīng)的臨床癥狀也有明顯改善作用,改善癥狀優(yōu)于西藥組,且未呈現(xiàn)不良反應(yīng)。單細胞膜片鉗研究表明,參松養(yǎng)心對多種離子通道具有阻滯作用。最近有研究利用超高液相色譜-光譜法對口服參松養(yǎng)心原粉的大鼠的尿液進行檢測,發(fā)現(xiàn)含有至少十種有效成分。由此我們推測,參松養(yǎng)心對梗死后心律失常的防治具有多重干預(yù)作用。然而,直到目前為止,有關(guān)參松養(yǎng)心對MI后心肌電生理的具體調(diào)節(jié)作用及機制研究甚少�；诖宋覀冞M行了本次的實驗研究。本實驗采用結(jié)扎家兔冠狀動脈左回旋支制作心梗模型,應(yīng)用在體電生理記錄技術(shù),微電極陣歹(Microelectrode array, MEA)技術(shù)等觀察參松養(yǎng)心對梗死后兔缺血心肌在體電生理特性及電傳導(dǎo)的影響,初步揭示其可能的作用機制。利用應(yīng)用心肌聲學(xué)微泡造影技術(shù)、透射電鏡技術(shù)、CD34免疫熒光雙標測技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)觀察參松養(yǎng)心對梗死2周家兔梗死周邊區(qū)心肌組織重構(gòu)及微循環(huán)灌注功能的影響,并運用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測有關(guān)蛋白的表達水平,探討其可能的作用機制。方法本研究分為以下三部分內(nèi)容：一、心肌梗死兔心肌電生理改變及參松養(yǎng)心的干預(yù)作用研究以日本大耳兔為研究對象,采用結(jié)扎家兔冠狀動脈左回旋支制作心梗模型,分以下4組：假手術(shù)組(sham operation, SO; n=8)、心梗對照組(myocardial infarction, MI; n=8)、心梗胺碘酮組(myocardial infarction with amiodarone, AD;n=8)、心梗參松養(yǎng)心組(myocardial infarction with Shensong Yangxin, SSYX; n=8)。術(shù)后第2天,心梗胺碘酮組以胺碘酮0.05g/kg/d灌胃給藥,心梗參松養(yǎng)心組以參松養(yǎng)心原粉0.4g/(kg.d)灌胃給藥,假手術(shù)組和心梗對照組以等體積生理鹽水灌胃給藥,各組連續(xù)灌胃2周。于末次給藥后禁食12小時,各組家兔行在體MEA檢測,記錄周邊區(qū)心肌組織場電位(FP)指標,包括場電位最大負值(FPmin)、場電位持續(xù)時間(Fpdur)、總的激動時間(TAT)、TAT離散度和電興奮傳導(dǎo)速度(CV),并觀察電激動傳導(dǎo)方向變化情況。利用LEAD2000在體電生理記錄儀檢測周邊區(qū)心肌單相動作電位時程(MAPD)、有效不應(yīng)期(ERP)、跨壁復(fù)極離散度(TDR)和室顫閾值(VFT)變化。運用Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測各組模型周邊區(qū)心肌組織中縫隙連接蛋白43(CX43)和KV6.2 mRNA及蛋白的表達水平。二、心肌梗死兔心室重構(gòu)及參松養(yǎng)心的干預(yù)作用研究實驗動物、分組及造模方法同第一部分。運用心臟二維超聲動檢測各組家兔心功能變化,檢測指標包括左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)經(jīng)(LVESD)、左心室舒張末期容積(LVEDV)、左心室收縮末期容積(LVESV)左心室短軸縮短率(LVFS)、左心室射血分數(shù)(LVEF)和E/A值。HE染色觀察梗死周邊區(qū)心肌組織的形態(tài)學(xué)改變。透射電鏡觀察周邊區(qū)心肌細胞的超微結(jié)構(gòu)變化。采用Masson三色染色觀察周邊區(qū)心肌組織膠原纖維的增生情況。運用Real-time PCR技術(shù)檢測周邊區(qū)心肌肌漿網(wǎng)Ca^2+-ATP酶-2a(SERCA2a)、鈣離子釋放通道蛋白-2(RYR2)、受磷蛋白(PLB)、鈉鈣交換體-1(NCX1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP2)和金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP9) mRNA的表達水平。Western blot檢測周邊區(qū)心肌中SERCA2a、RYR2、PLB、NCX1、I型膠原蛋白(COL Ⅰ)和Ⅲ型膠原蛋白(COL Ⅲ)蛋白表達量。三、心肌梗死兔缺血心肌微循環(huán)損傷及參松養(yǎng)心的干預(yù)作用研究實驗動物、分組及造模方法同第一部分。運用心臟超聲微泡造影技術(shù)分別于手術(shù)前、術(shù)后1天及術(shù)后2周對各組模型行心肌超聲造影檢測,記錄指標包括給予Flash后再充盈穩(wěn)定時的平臺期峰值強度A、曲線斜率β以及A×β值；ELISA法檢測各組血漿一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、血栓素2(TXA2)和血管性血友病因子(vWF)水平；利用透射電鏡觀察各組家兔周邊區(qū)心肌組織微血管內(nèi)皮細胞的超微結(jié)構(gòu)變化；采用CD34免疫熒光雙染色法觀察參松養(yǎng)心對梗死家兔周邊區(qū)心肌微血管密度的干預(yù)情況；運用Real-time PCR技術(shù)檢測周邊區(qū)心肌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF、ET-1、前列腺素I 2(PGI2)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS) mRNA的表達水平；Western blot檢測周邊區(qū)心肌中血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)蛋白表達量。結(jié)果一、心肌梗死兔心肌電生理改變及參松養(yǎng)心的干預(yù)作用研究各組家兔MEA記錄結(jié)果：與假手術(shù)組相比,心梗對照組周邊區(qū)心肌組織FPmin、FPdur和CV明顯減小,TAT和TAT離散度顯著增大(P0.05)；心肌電興奮傳播方向紊亂,等電位線雜亂排列密集,可見異位興奮灶。與心梗對照組比較,心梗胺碘酮組周邊區(qū)心肌組織FPmin和CV明顯減小,FPdur明顯增大(P0.05),兩組之間TAT和TAT離散度未見統(tǒng)計學(xué)差異；電興奮傳播方向紊亂改變不明顯。與心梗胺碘酮組相比,心梗參松組周邊區(qū)心肌組織FPdu、TAT和TAT離散度明顯減小,FPmin和CV明顯增大；電傳導(dǎo)方向規(guī)整,且等電位線排列明顯變疏。各組家兔心肌在體電生理檢測結(jié)果：與假手術(shù)對照組比較,心梗對照組梗死周邊區(qū)三層心肌MAPD90 (MAPD90.Ep、MAPD90.Mid、MAPD90.Endo)明顯縮短,ERP、TDR顯著增大,VFT明顯降低(P0.05)。與心梗對照組比較,心梗胺碘酮組和心梗參松組三層心肌MAPD90(MAPD90.Epi、MAPD90.Mid、MAPD90.Endo)和ERP均明顯延長(P0.05)。與心梗胺碘酮組相比,心梗參松組三層心肌MAPD90(MAPD90.Epi、MAPD90.Mid、MAPD90.Endo)明顯小于心梗胺碘酮組(P0.05),兩組間ERP、TDR和VFT無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。各組家兔周邊區(qū)心肌CX43和KV6.1mRNA及蛋白的表達：與假手術(shù)組相比,心梗對照組和心梗胺碘酮組CX43 mRNA和蛋白表達量明顯減少,KV6.2mRNA和蛋白表達量顯著升高(P0.05)。與心梗對照組和心梗胺碘酮組相比,參松養(yǎng)心顯著增加梗死周邊區(qū)心肌組織CX43 mRNA和蛋白表達量,KV6.2mRNA和蛋白表達量明顯降低(P0.05)。二、心肌梗死兔心室重構(gòu)及參松養(yǎng)心的干預(yù)作用研究各組家兔心臟功能檢測結(jié)果：與假手術(shù)對照組相比,心梗對照組家兔心功能明顯降低(P0.05)。與心梗對照組比較,心梗胺碘酮組LVESD、LVESV減小(P0.05)；心梗參松組LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV減小(P0.05),LVFS、LVEF、E/A值增大(P0.05)。與心梗胺碘酮組比較,心梗參松組LVESD、 LVEDV、LVESV減小(P0.05), LVEF、E/A值增大(P0.05)。各組家兔周邊區(qū)心肌HE染色及透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果：心梗對照組家兔周邊區(qū)心肌組織形態(tài)學(xué)改變顯著,表現(xiàn)為細胞排列紊亂,可見萎縮、斷裂的肌纖維,局部出現(xiàn)明顯灶性壞死。透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為,心梗對照組心肌纖維排列紊亂,Z線粗細不等,甚至斷裂或消失；心肌間質(zhì)及核周有明顯水腫；線粒體形態(tài)各異,膜結(jié)構(gòu)不清晰,部分膜融合不清晰,線粒體嵴紊亂或消失,部分線粒體出現(xiàn)空化現(xiàn)象。心梗胺碘酮組較心梗對照組壞死有一定程度減輕,但細胞仍明顯腫大；電鏡下可見心肌間質(zhì)及核周圍有明顯水腫,Z線排列雖較為整齊,但粗細不均、比較模糊,線粒體局部可見空泡、線粒體嵴紊亂。相對于前兩組,心梗參松組心肌細胞壞死程度明顯降低。電鏡下心肌纖維排列有序,間質(zhì)基本無水腫,大部分線粒體形態(tài)正常。各組家兔周邊區(qū)心肌膠原纖維的變化：Masson染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組心肌纖維束排列緊密,心肌纖維間未見有明顯膠原纖維增生。心梗對照組可見大面積膠原纖維增生,并呈網(wǎng)狀分布于心肌纖維束之間。心梗胺碘酮組和心梗參松組周邊區(qū)心肌組織膠原纖維增生有不同程度減輕,其中心梗參松組較心梗胺碘酮組膠原纖維增生減輕更為明顯。各組家兔周邊區(qū)心肌SERCA2a、RYR2、PLB、NCX1、TGF-β1和MMP-2mRNA表達：與對照組相比,心梗對照組周邊區(qū)心肌SERCA2a、RyR2、PLB、 NCX1 mRNA水平顯著下降,TGF-β1和MMP-2 mRNA水平顯著升高(p0.05)。與心梗對照組相比,心梗胺碘酮組周邊區(qū)心肌SERCA2a、PLB、TGF-β1及MMP-2mRNA表達水平未見明顯改變,而RyR2、NCX1 mRNA表達增高(p0.05)；心梗參松組周邊區(qū)心肌SERCA2a、RyR2、PLB、NCX1 mRNA表達均明顯升高,TGF-β1、MMP-2 mRNA表達均明顯下降(p0.05)。各組家兔周邊區(qū)心肌SERCA2a、RYR2、PLB、NCX1、COL Ⅰ和COLⅢ蛋白表達：與假手術(shù)組相比,心梗對照組SERCA2a、RYR2、PLB和NCXl蛋白表達量明顯減少,COL Ⅰ和COLⅢ蛋白含量明顯升高(P0.05)。與心梗對照組相比,心梗胺碘酮組和心梗參松組SERCA2a、RYR2、PLB和NCX1蛋白表達明顯增多,心梗參松組COL Ⅰ和COLⅢ蛋白表達量均明顯降低(P0.05),相對于心梗胺碘酮組,心梗參松組各個指標改善更為顯著(P0.05)。三、心肌梗死兔缺血心肌微循環(huán)損傷及參松養(yǎng)心的干預(yù)作用研究各組家兔周邊區(qū)心肌組織微循環(huán)灌注量的變化：與假手術(shù)組比較,心梗對照組和心梗胺碘酮組術(shù)后2周A值、p值、A*p值均明顯減小(P0.05)。與心梗對照組和心梗胺碘酮組比較,心梗參松組A值、p值、A*p值均明顯升高(P0.05)。各組家兔周邊區(qū)心肌組織微血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)的變化：假手術(shù)組微血管超微結(jié)構(gòu)清晰,管腔光滑,基膜連續(xù)而完整,內(nèi)皮細胞間緊密連接正常。心梗對照組微血管基膜不完整、緊密連接模糊,管腔不規(guī)則,細胞內(nèi)未見明顯線粒體結(jié)構(gòu)。心梗參松組毛細血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)明顯改善,可見緊密連接較明顯,官腔較為光滑,線粒體融合、空泡化明顯減輕。各組家兔周邊區(qū)心肌組織微血管密度的變化：與假手術(shù)組相比,心梗對照組和心梗胺碘酮組CD34陽性計數(shù)和微血管相對密度均明顯降低(P0.05)。與心梗對照組相比,心梗參松組周邊區(qū)心肌組織CD34陽性計數(shù)和微血管相對密度顯著增加(P0.05)。各組家兔血清TXA2、ET-1、vWF及NO水平：與假手術(shù)組相比,心梗對照組和心梗胺碘酮組TXA2、ET-1、vWF及NO明顯升高(P0.05)。與心梗對照組和心梗胺碘酮組相比,心梗參松組血清TXA2、ET-1、vWF水平均明顯降低(P0.05)。各組家兔周邊區(qū)心肌VEGF、ET-1、PGI2和eNOS mRNA表達：與假手術(shù)組相比,心梗對照組和心梗胺碘酮組VEGF和ET-1 mRNA表達量明顯升高,PGI2、eNOS mRNA表達量明顯降低(P0.05)。與心梗對照組和心梗胺碘酮組比較,心梗參松組ET-1 mRNA表達量明顯降低,VEGF、PGI2、eNOS mRNA表達量明顯升高(P0.05)(P0.05)。各組家兔周邊區(qū)心肌TM蛋白表達：與假手術(shù)組相比,心梗對照組和心梗胺碘酮組TM蛋白表達量明顯減少(P0.05)。與心梗對照組相比,心梗參松組TM蛋白表達明顯增多(P0.05)。結(jié)論1.參松養(yǎng)心對心肌梗死家兔周邊區(qū)心肌在體電生理效應(yīng)與胺碘酮相似,但不如胺碘酮顯著；然其對電興奮的傳播具有明顯優(yōu)化效應(yīng)。參松養(yǎng)心延長周邊區(qū)心肌APD可能與下調(diào)Kv6.2的表達相關(guān),提高電傳導(dǎo)速度可能與上調(diào)CX43的表達相關(guān)。2.參松養(yǎng)心對心肌梗死家兔心功能有明顯改善作用,揭示了參松養(yǎng)心通過上調(diào)梗死周邊區(qū)心肌鈣離子調(diào)控相關(guān)基因SERCA2ATPase、RYR2、PLB、NCX1表達改善心臟收縮功能,通過下調(diào)TGF-β和MMP-2表達抑制心肌膠原纖維病理性增生。3.參松養(yǎng)心對心肌梗死家兔周邊區(qū)心肌組織微循環(huán)具有明顯改善作用,證實參松養(yǎng)心通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性舒張和收縮活性物質(zhì)之間的平衡,改善微循環(huán),提高心肌組織的血氧供應(yīng)；通過上調(diào)VEGF的表達促進周邊區(qū)心肌微血管的新生。
【圖文】：

圖１－１邋ＭＥＡ巧個記錄電化及場電位（巧）指標說明逡逑

邐Ｉ逡逑！邋ｉＦＰｍｉｎ邐＇逡逑圖１－１邋ＭＥＡ巧個記錄電化及場電位（巧）指標說明逡逑Ｉ邐ｎ？逡逑Ｉ邋ｖ＼．？八邋Ａ＇Ｊ邋ＶＷＶＷｖｗ八Ｖ＇ｖＶ＼ＡＡ／ｖＶｖＶ邋．．邋Ｊ邋ｌ邋－：逡逑ｉｌ邐＇邐Ｉ邋ｔ邋＊逡逑Ｊ邐．１－１逡逑」邋一一邋１邐＾逡逑ｓ邋＇從Ｗ從林？Ｗ４＇‘
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R542.22
，

本文編號：2526270