【摘要】：高血壓、冠心病、心肌梗塞、糖尿病性心肌病以及瓣膜性心臟病等疾病均會(huì)引起心室重構(gòu)及心功能不全,導(dǎo)致病理性心肌肥厚的發(fā)生。病理性的心肌肥厚是導(dǎo)致心力衰竭(Heart failure,HF)的重要因素之一,且由于其病理機(jī)制復(fù)雜,目前尚未發(fā)現(xiàn)防治心肌肥厚有效方法。目前的研究發(fā)現(xiàn),心肌肥厚時(shí),心臟中自噬的水平會(huì)發(fā)生變化。自噬過程中會(huì)形成自噬溶酶體,將細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、變形的蛋白質(zhì)以及病原體等進(jìn)行降解,提供細(xì)胞所需要的能量,進(jìn)而維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。心肌細(xì)胞中自噬處于正常水平時(shí),其能夠維持心臟結(jié)構(gòu)和功能,但自噬被過度激活時(shí)會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡。血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)內(nèi)主要活性物質(zhì),Ang Ⅱ水平的升高導(dǎo)致機(jī)體心肌肥厚。大量的研究表明,自噬在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚中有著重要的作用,但對(duì)于自噬在Ang Ⅱ 誘導(dǎo)的肥厚中的作用及機(jī)制尚未有定論。對(duì)于自噬通路的研究,將有利于從自噬的角度探討Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心臟肥厚的發(fā)生發(fā)展過程及機(jī)制,明確心肌細(xì)胞自噬與心肌肥厚的關(guān)系以及對(duì)心肌細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié),將為研發(fā)新的治療或預(yù)防心肌肥厚、繼而心衰以及心肌梗死等心臟病疾病的藥物尋找靶點(diǎn)。木犀草素-7-O-葡萄糖苷(Luteolin-7-O-glucoside,LUTG)是一種青蘭屬植物提取的黃酮類化合物,能夠減輕心肌損傷。前期研究發(fā)現(xiàn)LUTG能夠減輕抗腫瘤藥物多柔比星導(dǎo)致的心臟毒性;LUTG還能夠通過調(diào)控自噬減輕心肌饑餓損傷。但目前對(duì)于LUTG在Ang Ⅱ?qū)е碌男募》屎袷欠裼凶饔靡约捌渚唧w的作用機(jī)制尚未見報(bào)道。本課題主要通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn),對(duì)LUTG在Ang Ⅱ?qū)е碌男募》屎裰械淖饔眠M(jìn)行了研究,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討,為開發(fā)逆轉(zhuǎn)心肌肥厚的藥物奠定基礎(chǔ)。體外實(shí)驗(yàn):MTT實(shí)驗(yàn)顯示,低濃度的LUTG(≤20μmol/L)時(shí),LUTG對(duì)H9c2細(xì)胞的活力影響不大(P0.05);隨著LUTG濃度升高,當(dāng)LUTG濃度≥40μmol/L時(shí)會(huì)促進(jìn)心肌細(xì)胞細(xì)胞增殖。采用Ang Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥厚模型,細(xì)胞拍照,并用Image Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞表面積,結(jié)果顯示20μmol/L LUTG能夠逆轉(zhuǎn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌表面積的增加;采用BCA法測(cè)定蛋白濃度,結(jié)果顯示LUTG能夠降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)的蛋白濃度的升高;采用Real-time PCR檢測(cè)ANP mRNA的表達(dá),結(jié)果表明,LUTG能夠降低心肌細(xì)胞ANPmRNA的表達(dá)。以上結(jié)果顯示,LUTG能夠改善Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚。采用DCFH-DA染色和MDA試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞ROS和MDA,結(jié)果顯示LUTG可減弱Ang Ⅱ處理組ROS水平和MDA含量;采用AO染色和LTG染色發(fā)現(xiàn),LUTG能夠抑制Ang Ⅱ?qū)е碌淖允伤降纳?Western blotting結(jié)果顯示:LUTG能夠降低Ang Ⅱ處理組DNA雙鏈損傷蛋白γ-H2AX的表達(dá)和Nrf2的入核,能夠降低自噬相關(guān)蛋白Beclinl的表達(dá)和LC3B2/LC3B1的比值,升高P62的表達(dá),上調(diào)p-Akt、Akt、mTOR和P-mTOR的蛋白表達(dá)。以上結(jié)果顯示:LUTG可能是通過抑制ROS的生成,影響Akt/mTOR通路,從而抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬。另外采用LTG染色以及Western blotting考察了 3-MA和LUTG合用對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌自噬水平的影響,結(jié)果顯示3-MA預(yù)處理可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)自噬水平的升高,3-MA和LUTG合用能夠協(xié)同抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)自噬水平的升高;為了進(jìn)一步研究LUTG逆轉(zhuǎn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚的機(jī)制,實(shí)驗(yàn)中選用NAC抑制細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS。DCFH-DA染色顯示NAC能夠降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)的ROS含量,NAC和LUTG合用能夠協(xié)同降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ROS濃度,對(duì)正常細(xì)胞影響不大。Western blotting結(jié)果顯示,NAC單獨(dú)使用和NAC聯(lián)合LUTG使用均能夠降低Ang Ⅱ處理組DNA雙鏈損傷蛋白γ-H2AX和Nrf2的表達(dá),能夠降低自噬相關(guān)蛋白Beclinl的表達(dá)和LC3B2/LC3B1的比值,升高P62的表達(dá),上調(diào)p-Akt、Akt、mTOR和p-mTOR的表達(dá)。結(jié)果顯示:LUTG可能是通過抑制ROS的產(chǎn)生影響Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):C57BL/6J小鼠皮下注射Ang Ⅱ(1.44mg/kg/d)構(gòu)建心肌肥厚模型,并持續(xù)灌胃給予LUTG(40mg/kg/d)8周。心臟形態(tài)拍照顯示:與溶劑對(duì)照組相比,模型組心臟體積增大,LUTG給藥組能減小心臟體積;HE染色的結(jié)果顯示:與溶劑對(duì)照組相比,模型組心肌細(xì)胞肥大、細(xì)胞顏色變淡、細(xì)胞核增大、部分細(xì)胞接觸部分出現(xiàn)融合。結(jié)果表明:LUTG給藥組降低了心肌細(xì)胞病理改變程度、減少心肌細(xì)胞表面積。結(jié)論:化合物L(fēng)UTG能逆轉(zhuǎn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚,可能是通過抑制ROS的產(chǎn)生,作用于Akt/mTOR通路抑制自噬從而抑制心肌肥厚的發(fā)生。
[Abstract]:Hypertension, coronary heart disease, myocardial infarction, diabetic cardiomyopathy, and valvular heart disease can cause ventricular remodeling and cardiac insufficiency, leading to the occurrence of pathological myocardial hypertrophy. Pathological myocardial hypertrophy is one of the most important factors leading to heart failure (HF). The current study found that the level of autophagy in the heart will change in the presence of cardiac hypertrophy. Autophagy lysosomes are formed during autophagy, and the damaged organelles, the deformed proteins and the pathogens in the cells are degraded to provide the energy required by the cells, and then the steady state in the cells is maintained. While autophagy in a cardiac muscle is at a normal level, it can maintain the structure and function of the heart, but may cause myocardial cell death when autophagy is overactivated. Angiotensin鈪，

本文編號(hào)：2480846