【摘要】：目的1.構(gòu)建mo-microRNA-486過表達(dá)腺病毒(Ad-miR-486)及mo-miR-486-antago腺病毒(Ad-miR-486-antago)。2.培養(yǎng)乳鼠原代心肌細(xì)胞,構(gòu)建心肌細(xì)胞低氧損傷模型以模擬急性缺血。3.應(yīng)用Ad-miR-486及Ad-miR-486-antago轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞,使得miR-486過表達(dá)及低表達(dá),觀察心肌細(xì)胞損傷及凋亡等生物學(xué)特性指標(biāo),以明確miR-486對(duì)心肌細(xì)胞缺血適應(yīng)的調(diào)節(jié)作用,并為臨床防治及減輕心肌缺血導(dǎo)致的損傷提供新的思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1.構(gòu)建攜帶miR-486的腺病毒載體,利用HEK293細(xì)胞對(duì)病毒進(jìn)行包裝、擴(kuò)增、純化,從而獲取大量攜帶miR-486的腺病毒,實(shí)時(shí)定量PCR鑒定擴(kuò)增的腺病毒,以TCID50法(50%組織細(xì)胞感染量)測(cè)定腺病毒感染滴度。2.構(gòu)建心肌細(xì)胞低氧損傷模型以模擬急性心肌缺血損傷過程。取出生1~3天的SD大鼠乳鼠,消毒后在無菌條件下分離純化心室肌細(xì)胞置于(37℃,5%CO_2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng),72小時(shí)后換以無血清DMEM培養(yǎng)12小時(shí)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分別于常氧培養(yǎng)箱(37℃,5%CO_2-95%Air)及低氧培養(yǎng)箱(37℃,1%O_2-94%N2-5%CO_2)培養(yǎng),48小時(shí)后收集各組細(xì)胞及細(xì)胞上清液。以常氧培養(yǎng)作為對(duì)照,測(cè)定細(xì)胞上清液乳酸脫氫酶(LDH)活性反應(yīng)細(xì)胞損傷程度,CCK-8法測(cè)定心肌細(xì)胞活性,pi染色檢測(cè)細(xì)胞周期,應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡程度,同時(shí)收獲細(xì)胞提取總RNA,通過real-time PCR測(cè)定心肌細(xì)胞低氧培養(yǎng)下的miR-486的表達(dá)變化。3.miR-486過表達(dá)和低表達(dá)的干預(yù)實(shí)驗(yàn)。以構(gòu)建的A的-miR-486及Ad-miR-486-antago轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞模擬miR-486過表達(dá)和低表達(dá)過程,實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)常氧培養(yǎng)組;(2)低氧培養(yǎng)組;(3)轉(zhuǎn)染A的-miR-486常氧培養(yǎng)組;(4)轉(zhuǎn)染Ad-miR-486-antago常氧培養(yǎng)組;(5)轉(zhuǎn)染Ad-miR-486低氧培養(yǎng)組;(6)轉(zhuǎn)染Ad-miR-486-antago低氧培養(yǎng)組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集細(xì)胞及上清液測(cè)定上述指標(biāo)。結(jié)果1.利用HEK293細(xì)胞包裝擴(kuò)增的Ad-gfp,Ad-miR-486及Ad-miR-486-antago,純化后Ad-gfp感染滴度為2×1011pfu/ml,Ad-miR-486和Ad-miR-486-antago感染滴度為1×10~（11）PFU/ml。2.心肌細(xì)胞低氧損傷模型的構(gòu)建。與常氧培養(yǎng)的心肌細(xì)胞相比,低氧培養(yǎng)24小時(shí)后心肌細(xì)胞表面積減少、細(xì)胞間隙變大、培養(yǎng)液中懸浮的死細(xì)胞增多、細(xì)胞搏動(dòng)節(jié)律明顯變慢。3.原代心肌細(xì)胞在低氧條件下培養(yǎng)6h、12h、24h、36h、48h后,檢測(cè)miR-486表達(dá)的變化,0~24h內(nèi)miR-486表達(dá)明顯上調(diào),至24h達(dá)到最高,24h~48h內(nèi)miR-486表達(dá)逐漸下調(diào)。4.低氧培養(yǎng)下,轉(zhuǎn)染Ad-miR-486后較低氧空白對(duì)照組細(xì)胞ldh活性下降了64%,細(xì)胞活力上升了28%,細(xì)胞凋亡率下降了23%;轉(zhuǎn)染Ad-miR-486-antago后較低氧空白對(duì)照組細(xì)胞LDH活性上升了30%,細(xì)胞活力下降了40%,細(xì)胞凋亡率上升了44%。結(jié)論原代心肌細(xì)胞在低氧培養(yǎng)下,miR-486的表達(dá)明顯上調(diào),至24h達(dá)到高峰,過表達(dá)的miR-486可以降低低氧條件下細(xì)胞凋亡率、提高細(xì)胞活力、減輕細(xì)胞損傷,而低表達(dá)的miR-486則增加了低氧條件下細(xì)胞凋亡率、降低了細(xì)胞活力、增加了細(xì)胞損傷。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-486在心肌細(xì)胞缺氧狀態(tài)下能夠減輕細(xì)胞損傷、抑制凋亡,具有一定的心肌保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R541

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2438453