發(fā)布時(shí)間：2019-03-11 18:35

【摘要】：目的分析重型再生障礙性貧血(Severe aplastic anemia,SAA)患者調(diào)節(jié)性自然殺傷細(xì)胞(CD56bright Natural Killer cells,CD56bright NK cells)數(shù)量、表面受體及產(chǎn)生細(xì)胞因子的水平;體外分離NK細(xì)胞,驗(yàn)證SAA患者NK細(xì)胞產(chǎn)生特定細(xì)胞因子的信號(hào)通路激活狀態(tài);探索SAA患者NK細(xì)胞對(duì)其他免疫細(xì)胞分化、增殖與功能的影響,揭示調(diào)節(jié)性NK細(xì)胞在SAA免疫發(fā)病機(jī)制中的作用,為細(xì)胞免疫治療提供理論依據(jù)。方法連續(xù)收集自2015年1月至2016年12月在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液內(nèi)科住院治療的SAA初治患者21例、治療后緩解患者21例為實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)對(duì)象,健康志愿者22例為正常對(duì)照。第一部分采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SAA初治患者、SAA恢復(fù)期患者(SAA response to immunosuppressive therapy,SAA-CR+PR)和正常對(duì)照者(Healthy Controls,HC)外周血NK細(xì)胞亞群(CD56bright NK細(xì)胞和CD56d im NK細(xì)胞)數(shù)量并與患者臨床指標(biāo)做相關(guān)性分析。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞亞群表面激活性受體NKp46、NKp44、NKG2D,抑制性受體NKG2A、CD158a、CD158b,胞內(nèi)蛋白穿孔素、顆粒酶B,粘附分子DNAM-1,胞內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17a、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β的表達(dá)情況。檢測(cè)SAA患者外周血血漿IL-2和IL-12水平,分選正常對(duì)照者CD56bright NK細(xì)胞,以rh IL-2和rh IL-12體外刺激培養(yǎng),實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q RT-PCR)檢測(cè)不同時(shí)間段IFN-γ和IL-10 m RNA表達(dá)。第二部分免疫磁珠分選初治SAA、緩解期SAA和正常對(duì)照者NK細(xì)胞,應(yīng)用rh IL-2和rh IL-12體外刺激培養(yǎng),酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)NK細(xì)胞上清IFN-γ、IL-10和TGF-β水平,q RT-PCR檢測(cè)IFN-γ、IL-10、TGF-β、STAT4、p38、STAT6 m RNA的表達(dá),蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)NK細(xì)胞STAT4、p-STAT4、p38、p-p38的表達(dá)。第三部分免疫磁珠分選SAA和正常對(duì)照者NK細(xì)胞,分別與SAA患者免疫磁珠分選且體外激活的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和誘導(dǎo)分選的髓樣樹突狀細(xì)胞(myeloid Dendritic Cells,m DC)共培養(yǎng),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞經(jīng)自體CD4+T細(xì)胞刺激前后脫顆粒水平、CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)前后Th1、Th2、Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells,Treg)數(shù)量、CD8+T細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞毒性顆粒(穿孔素和顆粒酶B)的表達(dá)、m DC表面共刺激分子CD86、CD80表達(dá),CCK-8檢測(cè)CD8+T細(xì)胞和m DC增殖活性,q RT-PCR檢測(cè)CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、RORγt和FOXP3 m RNA的表達(dá)。結(jié)果第一部分初治SAA患者CD56bright NK/NK百分比為(4.33±2.53)%,較HC組(7.46±2.53)%顯著降低(p=0.001),而初治SAA患者CD56dim NK/NK百分比(95.67±2.54)%與正常對(duì)照者未見明顯差異;初治SAA患者CD56brightNK絕對(duì)值為(3.26±2.85)×106/L,較HC組(10.94±5.34)×106/L明顯降低(p0.01),CD56brightNK絕對(duì)值隨SAA病情緩解而上升為(10.13±6.81)×106/L(p0.01)。初治SAA患者CD56bright NK細(xì)胞絕對(duì)值與血小板(PLT)絕對(duì)值(R=0.735,p0.01)、網(wǎng)織紅細(xì)胞(Ret)絕對(duì)值(R=0.755,p0.01)、Ret百分比(R=0.670,p0.01)呈正相關(guān)。初治SAA患者CD56brightNK細(xì)胞NKp46陽性率(99.61±0.61)%及平均熒光強(qiáng)度(MFI)(361.56±70.71)均高于HC陽性率(81.27±7.09)%及MFI(118.58±48.76)(p0.01)。初治SAA患者CD56brightNK細(xì)胞NKp44陽性率(13.37±6.65)%及MFI(14.17±4.43)明顯高于正常對(duì)照者陽性率(3.55±3.32)%及MFI(5.91±2.12)(p0.01)。SAA初治患者CD56bright NK細(xì)胞NKG2D之MFI(216.82±50.07)明顯高于HC(126.42±37.84)(p0.01)。初治SAA患者CD56brightNK細(xì)胞NKG2A陽性率(63.49±23.66)%較HC(83.09±14.83)%明顯降低(p=0.006)。初治SAA患者CD56brightNK細(xì)胞表達(dá)極低的CD158a和CD158b,與HC比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。初治SAA患者產(chǎn)生穿孔素、顆粒酶B的CD56brightNK細(xì)胞百分比與緩解期SAA、正常對(duì)照者無明顯差異。初治SAA患者(96.68±1.73)%的CD56bright NK細(xì)胞呈現(xiàn)DNAM-1+,高于HC(94.49±2.15)%(p=0.020)。PMA刺激后,初治SAA患者產(chǎn)生IFN-γ的CD56bright NK細(xì)胞為(17.0±4.1)%,較正常對(duì)照者(23.2±6.4)%明顯減低(p=0.010)。初治SAA患者產(chǎn)生IL-10的CD56brightNK細(xì)胞百分比為(5.19±2.60)%高于緩解期SAA(3.42±1.14)%(p=0.031)及對(duì)照(2.36±0.58)%(p0.01)。初治SAA患者產(chǎn)生IL-4的CD56brightNK細(xì)胞占(0.95±0.42)%,高于緩解期SAA(0.56±0.25)%(p=0.002)及對(duì)照(0.34±0.22)%(p0.01)。初治SAA患者的CD56brightNK細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β的百分比為(5.57±2.43)%,高于緩解期SAA(3.94±0.81)%(p=0.040)及對(duì)照(3.19±0.48)%(p=0.002)。SAA患者CD56b rightNK產(chǎn)生IL-17a、TNF-α、IL-13的水平與對(duì)照無差異。初治SAA患者血漿IL-2、IL-12濃度分別為(156.3±23.5)和(28.9±6.1)pg/m L,明顯高于緩解期SAA(IL-2:(112.6±27.3)pg/m L、IL-12:(22.4±7.9)pg/m L)(p0.01),及對(duì)照(IL-2:(30.0±8.6)pg/m L、IL-12:(20.4±5.1)pg/m L)(p0.01)。免疫磁珠分選的健康對(duì)照者的CD56bright NK細(xì)胞純度大于70%。對(duì)照者的CD56bright NK細(xì)胞IFN-γm RNA相對(duì)表達(dá)量在rh IL-2和rh IL-12刺激3天時(shí)明顯升高(1.44±0.13)(p=0.009),刺激7天時(shí)明顯下降(0.79±0.12)(p=0.002)。對(duì)照者的CD56bright NK細(xì)胞IL-10 m RNA相對(duì)表達(dá)量在rh IL-2和rh IL-12刺激3天時(shí)未見明顯變化(1.24±0.54),刺激7天時(shí)出現(xiàn)升高(2.67±1.29)(p=0.026)。第二部分分選NK細(xì)胞純度大于95%。初治SAA患者NK細(xì)胞分泌IFN-γ為(95.6±36.1)pg/m L,較緩解期SAA(100.4±38.5)pg/m L及對(duì)照(105.3±54.4)pg/m L有下降趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。初治SAA患者NK細(xì)胞IFN-γm RNA相對(duì)表達(dá)量為(0.09±0.05)明顯低于緩解期SAA(0.67±0.32)(p0.01)及對(duì)照(1.04±0.32)(p0.01)。初治SAA患者NK細(xì)胞STAT4 m RNA相對(duì)表達(dá)量(中位數(shù)為0.25(0.01,1.53))明顯低于正常對(duì)照者(中位數(shù)0.93(0.18,4.92))(p=0.001)。Western Blot檢測(cè)初治SAA患者NK細(xì)胞STAT4激活率(p-STAT4/STAT4)為(0.76±0.09),低于緩解期SAA患者(0.87±0.09)(p=0.020)和正常對(duì)照者(0.95±0.10)(p0.01)。初治SAA患者NK細(xì)胞分泌IL-10水平(16.5±6.9)高于緩解期SAA(11.0±7.5)(p=0.012)及正常對(duì)照者(9.3±6.6)(p=0.005)。初治SAA患者NK細(xì)胞IL-10 m RNA相對(duì)表達(dá)量為(4.01±2.37)高于緩解期SAA(2.84±2.95)(p=0.030)及正常對(duì)照者(1.75±1.79)(p0.01)。初治SAA患者NK細(xì)胞p38 m RNA相對(duì)表達(dá)量(2.25±1.26)高于正常對(duì)照者(1.51±1.32)(p=0.038)。初治SAA患者NK細(xì)胞p38激活率(p-p38/p38)為(1.08±0.22),高于緩解期SAA患者(0.83±0.16)(p=0.003)和正常對(duì)照者(0.64±0.13)(p0.01)。初治SAA患者NK細(xì)胞STAT6 m RNA相對(duì)表達(dá)量(中位數(shù)3.41(0.33,10.41))高于對(duì)照者(中位數(shù)1.36(0.27,4.08))(p=0.001)。初治SAA患者NK細(xì)胞分泌TGF-β水平(93.2±39.0)高于對(duì)照者(61.4±17.5)(p=0.009)。初治SAA患者NK細(xì)胞TGF-βm RNA相對(duì)表達(dá)量為(3.45±2.37)高于對(duì)照者(1.60±1.48)(p=0.007)。第三部分分選NK、CD4+T、CD8+T細(xì)胞純度均大于95%。誘導(dǎo)分選m DC細(xì)胞純度大于70%。當(dāng)經(jīng)rh IL-2培養(yǎng)刺激的NK細(xì)胞與自體激活的CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后,初治SAA患者CD107a+NK細(xì)胞百分比(28.68±12.44)%明顯較對(duì)照者升高(17.05±9.04)%(p=0.017)。初治SAA患者Th1細(xì)胞數(shù)量及Th1/Th2比例較對(duì)照者明顯升高。與初治SAA患者NK細(xì)胞共培養(yǎng)后,CD4+T細(xì)胞中Th1細(xì)胞數(shù)量減少、T-bet m RNA相對(duì)表達(dá)量(0.99±0.54)降低,Th2細(xì)胞數(shù)量增多、GATA3 m RNA相對(duì)表達(dá)量(1.94±0.96)增多,Th1/Th2比例下降。初治SAA患者Th17細(xì)胞數(shù)量升高、Treg數(shù)量下降、Th17/Treg比例升高。初治SAA患者CD4+T細(xì)胞與SAA來源的NK細(xì)胞共培養(yǎng)后,Th17細(xì)胞數(shù)量減少、RORγt m RNA相對(duì)表達(dá)量(0.55±0.40)降低,Treg細(xì)胞數(shù)量升高、FOXP3 m RNA相對(duì)表達(dá)量(2.00±0.91)升高,Th17/Treg比例下降。與初治SAA患者NK細(xì)胞共培養(yǎng)(+SAA NK)的CD8+T細(xì)胞增殖抑制率(4.50±1.79)%與HC的NK細(xì)胞共培養(yǎng)(+HC NK)抑制率(3.44±1.31)%無明顯差異。但+HC NK組CD8+T細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B表達(dá)率(分別為(29.70±6.18)%和(45.26±9.01)%)較無NK共培養(yǎng)組(Ctrl)(分別為(24.75±5.50)%和(35.29±7.41)%)升高(p0.05),而+SAA NK組未使CD8+T細(xì)胞胞內(nèi)穿孔素和顆粒酶B表達(dá)升高。+SAA NK組m DC細(xì)胞增殖抑制率(5.55±1.65)%高于+HC NK組抑制率(4.31±1.60)%(p=0.047)。+HC NK組m DC細(xì)胞CD80表達(dá)率(89.16±6.77)%較+SAA NK組(83.75±6.59)升高(p=0.037),各組間CD86表達(dá)沒有差異。結(jié)論1、SAA患者CD56bright NK細(xì)胞數(shù)量顯著減少,且與患者多項(xiàng)外周血細(xì)胞數(shù)指標(biāo)呈正相關(guān),即CD56bright NK細(xì)胞數(shù)量越少,病情越重,經(jīng)強(qiáng)化免疫抑制治療(IST)后CD56bright NK細(xì)胞數(shù)量有所改善。2、SAA患者CD56bright NK細(xì)胞激活性受體升高,抑制性受體降低,細(xì)胞處于激活狀態(tài);粘附分子表達(dá)DNAM-1增強(qiáng),可能具有更強(qiáng)的遷移能力,穿孔素和顆粒酶B產(chǎn)生較少,細(xì)胞毒性作用不明顯,產(chǎn)生Ⅰ型細(xì)胞因子(IFN-γ)減少,Ⅱ型細(xì)胞因子(IL-10、TGF-β)增多,可能起到調(diào)節(jié)SAA疾病狀態(tài)的作用。3、SAA患者外周血血漿IL-2和IL-12濃度升高。正常對(duì)照者CD56bright NK細(xì)胞在rh IL-2和rh IL-12刺激下呈現(xiàn)隨時(shí)間依賴性IFN-γ先升高后降低,IL-10隨時(shí)間升高,與IL-2的自調(diào)節(jié)作用可能相關(guān)。4、SAA患者NK細(xì)胞在rh IL-2和rh IL-12體外刺激下,JAK-STAT4—IFN-γ信號(hào)通路下調(diào),而p38 MAPK—IL10、TGF-β信號(hào)通路上調(diào),從而產(chǎn)生IFN-γ水平下降,IL10水平升高,IL-10的產(chǎn)生升高可能也與JAK-STAT6上調(diào)有關(guān)。5、SAA患者Th1/Th2和Th17/Treg升高。SAA患者CD4+T細(xì)胞體外在與SAA患者NK細(xì)胞共培養(yǎng)后,Th1/Th2和Th17/Treg比例下調(diào),即SAA患者NK細(xì)胞可參與調(diào)控CD4+T細(xì)胞分化以改善疾病情況的失平衡狀態(tài)。6、SAA患者NK細(xì)胞體外對(duì)CD8+T細(xì)胞增殖抑制沒有明顯作用,但較HC來源NK細(xì)胞可對(duì)CD8+T細(xì)胞胞內(nèi)穿孔素和顆粒酶B的產(chǎn)生具有一定下調(diào)作用,抑制CD8+T細(xì)胞的活化,改善SAA機(jī)體T細(xì)胞功能亢進(jìn)狀態(tài)。7、SAA患者NK細(xì)胞體外對(duì)m DC細(xì)胞增殖具有抑制作用。且對(duì)m DC細(xì)胞表面共刺激分子CD80表達(dá)具有一定下調(diào)作用,繼而減弱其抗原提呈能力,減弱T細(xì)胞激活。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R556.5
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本文編號(hào)：2438514