【摘要】：背景心力衰竭嚴(yán)重危害著人類的健康,心肌纖維化是終末期心力衰竭的共同病理特點(diǎn),心肌纖維化已成為心力衰竭治療的重要靶點(diǎn)。異常內(nèi)皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(Endothelial-mesenchymal transition,EndMT)是心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制之一,因此通過深入研究EndMT的機(jī)制并探索延緩甚至逆轉(zhuǎn)EndMT的有效藥物,可能為防治心力衰竭提供潛在的新型治療藥物。脂多糖可激活TLR4誘導(dǎo)EndMT促進(jìn)纖維化發(fā)展。高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)是 TLR4 的配體,且研究證明 HMGB1 通過 TGF-β1/Smad2/3通路誘導(dǎo)EMT促進(jìn)肺纖維化。雖沒有直接證據(jù)表明HMGB1通過TGF-β1/Smad2/3通路誘導(dǎo)EndMT,但EndMT是EMT的特殊類型,因此,同樣作為TLR4 配體的 HMGB1 可能通過 TLR4/NF-κB/TGF-β1/Smad2/3 通路誘導(dǎo) EndMT促進(jìn)心肌纖維化。研究表明姜黃素具有抗纖維化的作用,但姜黃素是否能夠通過抑制EndMT抗心肌纖維化尚不明確。方法分三部分:(1)查閱文獻(xiàn)初定候選濃度梯度,CCK8和Western blot確定姜黃素、AngⅡ、HMGB1藥物作用濃度。(2)初步探索姜黃素對AngⅡ誘導(dǎo)EndMT的影響及其機(jī)制;分組:1.對照組;2.AngⅡ組;3.姜黃素+AngⅡ組;4.氯沙坦+ AngⅡ組;顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組遷移能力;Western blot 檢測各組 VE-cadherin,α-SMA,TGF-β1 表達(dá)。(3)進(jìn)一步研究姜黃素對HMGB1誘導(dǎo)EndMT的影響及其機(jī)制:分組:1.對照組;2.HMGB1組;3.姜黃素+HMGB1 組;4.CLI-095+HMGB1 組;5.CLI-095(TLR4 特異性抑制劑)組;各組作用5天顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化;各組作用24小時(shí),劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組遷移能力,RT-QPCR 檢測各組 VE-cadherin,α-SMA,TGF-β1,collagen Ⅰ和 collagen Ⅲ的 mRNA 表達(dá),Western blot 檢測各組 VE-cadherin,α-SMA,TLR4,TGF-β1,collagen Ⅰ,Phospho-NF-κB p65,Phospho-Smad2/3 蛋白表達(dá)差異;免疫熒光顯示各組VE-cadherin,α-SMA表達(dá)情況。結(jié)果第一部分初篩作用濃度姜黃素為12.5μM,AngⅡ?yàn)?μM,HMGB1為800ng/ml。第二部分(1)HUVECs經(jīng)AngⅡ刺激形態(tài)改變,長梭形樣細(xì)胞增多;姜黃素和氯沙坦可維持內(nèi)皮細(xì)胞鋪路石樣形態(tài)。(2)相比對照組,AngⅡ促進(jìn)HUVECs的遷移(P0.05);相對AngⅡ組,加入姜黃素和氯沙坦抑制HUVECs 的遷移(P均 0.05);(3)AngⅡ可誘導(dǎo) EndMT,AngⅡ刺激后 VE-cadherin表達(dá)減弱(P=0.003),而α-SMA和TGF-β1的表達(dá)都明顯增強(qiáng)(P均0.01),姜黃素和氯沙坦使VE-cadherin表達(dá)明顯增加,而α-SMA和TGF-β1的表達(dá)均明顯下調(diào)。第三部分(1)HUVECs經(jīng)HMGB1刺激后可見長梭形樣細(xì)胞增多;姜黃素和TLR4特異性抑制劑CLI-095可維持內(nèi)皮細(xì)胞鋪路石樣形態(tài)。(2)與對照組相比,HMGB1促進(jìn)HUVECs的遷移(P0.05);相對HMGB1組,加入姜黃素和CLI-095抑制HUVECs的遷移(P均0.05);(3)RT-QPCR結(jié)果:相比對照組,HMGB1 組 VE-cadherin mRNA 表達(dá)減弱(P0.05),而 α-SMA,collagen Ⅰ,collagen Ⅲ和 TGF-βl 的 mRNA 表達(dá)均明顯升高(P 均0.01);與HMGB1 組相比,姜黃素 + HMGB1 組和 CLI-095+HMGB1 組的 VE-cadherin mRNA 表達(dá)明顯增加(P 均0.05),而 α-SMA,collagen Ⅰ 和 TGF-βl 的 mRNA表達(dá)均降低(P均0.05);(4)Western blot結(jié)果:與對照組相比,HMGB1刺激后 VE-cadherin 蛋白表達(dá)減弱(P0.05),而 α-SMA,collagen Ⅰ,Phospho-NF-κB,TGF-β1 和 Phospho-Smad2/3 的蛋白表達(dá)都升高(P 均0.01);與 HMGB1 組相比,姜黃素 + HMGB1 組和 CLI-095+HMGB1 組的 VE-cadherin表達(dá)明顯增加(P 均0.05),而 α-SMA,collagen I,Phospho-NF-κB,TGF-β1和Phospho-Smad2/3的蛋白表達(dá)均降低(P均0.05);(5)免疫熒光顯示:HMGB1組VE-cadherin蛋白(紅色)熒光明顯減弱,而α-SMA蛋白(綠色)熒光表達(dá)都增強(qiáng);與HMGB1組相比,姜黃素和CLI-095使VE-cadherin(紅色)熒光增加,而α-SMA綠色熒光顯示不明顯。結(jié)論1.姜黃素通過下調(diào)TGF-β1表達(dá)抑制由AngⅡ誘導(dǎo)的EndMT。2.HMGB1 通過激活 TLR4/NF-KB/TGF-β1/Smad2/3 信號通路誘導(dǎo) EndMT,促進(jìn)膠原蛋白的分泌。3.姜黃素和CLI-095可通過下調(diào)TLR4/NF-κB/TGF-β1/Smad2/3信號通路抑制HMGB1誘導(dǎo)的EndMT,減少膠原蛋白的分泌。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2426296