【摘要】：背景和目的：低氧性肺動(dòng)脈高壓(HPH)由急性或慢性肺泡缺氧所致,能導(dǎo)致右心肥大及右心功能不全。肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制中的研究熱點(diǎn)是肺血管重塑,主要表現(xiàn)為肺動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)細(xì)胞的異常增殖和遷移所致的肺動(dòng)脈壁增厚及遠(yuǎn)端無(wú)肌細(xì)動(dòng)脈的肌化。體外研究顯示,低氧可通過(guò)各種介質(zhì)刺激肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)的異常增殖和遷移,促進(jìn)肺血管重塑的發(fā)生。在前期研究中,本課題組利用蛋白組學(xué)技術(shù)比較分析常氧和低氧處理后的人PASMCs的蛋白表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)低氧時(shí)PASMCs的凝溶膠樣肌動(dòng)蛋白加帽蛋白(CapG)的表達(dá)明顯上調(diào),當(dāng)采用小干擾RNA的方法抑制CapG的表達(dá)后,低氧誘導(dǎo)PASMCs的遷移作用明顯降低。這提示CapG在低氧性肺血管重塑的發(fā)生中可能起了重要的作用。基于以上分析,我們推測(cè)局部抑制CapG能有效的抑制肺血管重塑,具有預(yù)防HPH的潛力。我們?cè)隗w外條件下探討CapG對(duì)大鼠原代PASMCs遷移、增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中研究CapG在HPH大鼠模型低氧性肺血管重塑和肺動(dòng)脈壓力升高過(guò)程中產(chǎn)生的作用。這些研究工作拓展了CapG的功能,可望為HPH的發(fā)病機(jī)制研究及其防治提供新的思路。方法：1、采用組織貼塊法和差速貼壁法分離大鼠原代PASMCs,采用免疫熒光法鑒定PASMCs及檢測(cè)CapG在PASMCs的分布。將PASMCs經(jīng)不同時(shí)間段(Oh,6h, 12h,24h,48h)低氧(1%02)干預(yù),用RT-PCR和Western blot的方法檢測(cè)PASMCs中CapG在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。2、設(shè)計(jì)并構(gòu)建干擾CapG基因的小干擾RNA si-CapG及對(duì)照小干擾RNA si-NC.大鼠PASMCs分為常氧si-NC組、常氧si-CapG組、低氧si-NC組、低氧si-CapG組,PASMCs轉(zhuǎn)染si-CapG或si-NC 48h之后,分別進(jìn)行常氧(21%02)或低氧(1%02)培養(yǎng)。用Transwell小室法檢測(cè)抑制CapG基因?qū)ASMCs遷移能力的影響,用CCK-8法檢測(cè)抑制CapG基因?qū)ASMCs細(xì)胞活力的影響,用EdU法檢測(cè)抑制CapG基因?qū)ASMCs增殖能力的影響,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抑制CapG基因?qū)ASMCs凋亡、細(xì)胞周期的影響。3、設(shè)計(jì)并構(gòu)建干擾CapG基因的慢病毒載體Lenti-CapG及對(duì)照慢病毒載體Lenti-NC.大鼠分為常氧對(duì)照組(n=8)、低氧對(duì)照組(n=6)、低氧干擾組(n=6)。將Lenti-CapG或Lenti-NC經(jīng)氣道內(nèi)滴注的方式感染大鼠,2周后將大鼠分別進(jìn)行常氧(21%02)或低氧(10%02)飼養(yǎng)。4周后檢測(cè)CapG在各組大鼠肺組織以及PASMCs的表達(dá),測(cè)定各組大鼠右心室收縮壓(RVSP)、右心室肥厚指數(shù)(RVHI).肺小動(dòng)脈管壁厚度占管徑的百分比(WT%)、肺無(wú)肌小動(dòng)脈的肌化程度。結(jié)果：1、成功分離、培養(yǎng)并鑒定大鼠原代PASMCs.免疫熒光法提示CapG在PASMCs的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)都有分布。大鼠原代PASMCs的CapG mRNA和蛋白表達(dá)量隨低氧培養(yǎng)時(shí)間增加而逐漸升高,一直持續(xù)至48 h。2、構(gòu)建的si-CapG能明顯下調(diào)PASMCs的CapG表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,低氧能促進(jìn)PASMCs遷移、提高細(xì)胞活性和促進(jìn)細(xì)胞增殖,但是低氧誘導(dǎo)了PASMCs凋亡卻促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換。不管是常氧還是低氧條件下,與si-NC組相比,si-CapG組的PASMCs遷移能力下降、細(xì)胞活性和增殖能力下降、細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡增多且出現(xiàn)了細(xì)胞周期(S+G2/M)期比例下降。3、構(gòu)建的Lenti-CapG能明顯下調(diào)PASMCs的CapG表達(dá)。通過(guò)氣道內(nèi)滴注的方式可以將慢病毒高效地整合到肺組織局部,在肺小動(dòng)脈壁和支氣管管壁表達(dá)尤為明顯。HPH大鼠模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,低氧對(duì)照組的RVSP、RVHI明顯高于常氧對(duì)照組,而低氧干擾組的RVSP、RVHI較低氧對(duì)照組下降。低氧對(duì)照組的WT%明顯高于常氧對(duì)照組、肺無(wú)肌小動(dòng)脈的肌化程度升高,低氧干擾組與低氧對(duì)照組相比WT%降低、肺無(wú)肌小動(dòng)脈的肌化程度下降。結(jié)論：低氧可誘導(dǎo)大鼠原代PASMCs中CapG的表達(dá)上調(diào),抑制CapG基因后,PASMCs的遷移能力下降、細(xì)胞活性和增殖能力降低、細(xì)胞凋亡增多、細(xì)胞周期(S+G2/M)期比例下降。以慢病毒為載體,通過(guò)氣道內(nèi)滴注的途徑,將干擾CapG基因表達(dá)的Lenti-CapG感染至大鼠肺組織,可以在肺組織局部高效表達(dá)慢病毒。在低氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓之前經(jīng)氣道滴注Lenti-CapG,可以緩解肺動(dòng)脈壓力的升高、肺血管的重塑以及右心室的肥厚。提示CapG有可能成為防治HPH的潛在靶標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R544.1

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本文編號(hào)：2412560