發(fā)布時間：2019-01-21 10:18

【摘要】：背景和目的：低氧性肺動脈高壓(HPH)由急性或慢性肺泡缺氧所致,能導致右心肥大及右心功能不全。肺動脈高壓發(fā)病機制中的研究熱點是肺血管重塑,主要表現為肺動脈壁結構細胞的異常增殖和遷移所致的肺動脈壁增厚及遠端無肌細動脈的肌化。體外研究顯示,低氧可通過各種介質刺激肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)的異常增殖和遷移,促進肺血管重塑的發(fā)生。在前期研究中,本課題組利用蛋白組學技術比較分析常氧和低氧處理后的人PASMCs的蛋白表達譜,發(fā)現低氧時PASMCs的凝溶膠樣肌動蛋白加帽蛋白(CapG)的表達明顯上調,當采用小干擾RNA的方法抑制CapG的表達后,低氧誘導PASMCs的遷移作用明顯降低。這提示CapG在低氧性肺血管重塑的發(fā)生中可能起了重要的作用�；谝陨戏治�,我們推測局部抑制CapG能有效的抑制肺血管重塑,具有預防HPH的潛力。我們在體外條件下探討CapG對大鼠原代PASMCs遷移、增殖、凋亡、細胞周期的影響,在體內實驗中研究CapG在HPH大鼠模型低氧性肺血管重塑和肺動脈壓力升高過程中產生的作用。這些研究工作拓展了CapG的功能,可望為HPH的發(fā)病機制研究及其防治提供新的思路。方法：1、采用組織貼塊法和差速貼壁法分離大鼠原代PASMCs,采用免疫熒光法鑒定PASMCs及檢測CapG在PASMCs的分布。將PASMCs經不同時間段(Oh,6h, 12h,24h,48h)低氧(1%02)干預,用RT-PCR和Western blot的方法檢測PASMCs中CapG在mRNA和蛋白水平的表達變化。2、設計并構建干擾CapG基因的小干擾RNA si-CapG及對照小干擾RNA si-NC.大鼠PASMCs分為常氧si-NC組、常氧si-CapG組、低氧si-NC組、低氧si-CapG組,PASMCs轉染si-CapG或si-NC 48h之后,分別進行常氧(21%02)或低氧(1%02)培養(yǎng)。用Transwell小室法檢測抑制CapG基因對PASMCs遷移能力的影響,用CCK-8法檢測抑制CapG基因對PASMCs細胞活力的影響,用EdU法檢測抑制CapG基因對PASMCs增殖能力的影響,用流式細胞術檢測抑制CapG基因對PASMCs凋亡、細胞周期的影響。3、設計并構建干擾CapG基因的慢病毒載體Lenti-CapG及對照慢病毒載體Lenti-NC.大鼠分為常氧對照組(n=8)、低氧對照組(n=6)、低氧干擾組(n=6)。將Lenti-CapG或Lenti-NC經氣道內滴注的方式感染大鼠,2周后將大鼠分別進行常氧(21%02)或低氧(10%02)飼養(yǎng)。4周后檢測CapG在各組大鼠肺組織以及PASMCs的表達,測定各組大鼠右心室收縮壓(RVSP)、右心室肥厚指數(RVHI).肺小動脈管壁厚度占管徑的百分比(WT%)、肺無肌小動脈的肌化程度。結果：1、成功分離、培養(yǎng)并鑒定大鼠原代PASMCs.免疫熒光法提示CapG在PASMCs的細胞核和細胞質內都有分布。大鼠原代PASMCs的CapG mRNA和蛋白表達量隨低氧培養(yǎng)時間增加而逐漸升高,一直持續(xù)至48 h。2、構建的si-CapG能明顯下調PASMCs的CapG表達。體外實驗結果顯示,低氧能促進PASMCs遷移、提高細胞活性和促進細胞增殖,但是低氧誘導了PASMCs凋亡卻促進細胞周期G1/S期轉換。不管是常氧還是低氧條件下,與si-NC組相比,si-CapG組的PASMCs遷移能力下降、細胞活性和增殖能力下降、細胞早期凋亡和晚期凋亡增多且出現了細胞周期(S+G2/M)期比例下降。3、構建的Lenti-CapG能明顯下調PASMCs的CapG表達。通過氣道內滴注的方式可以將慢病毒高效地整合到肺組織局部,在肺小動脈壁和支氣管管壁表達尤為明顯。HPH大鼠模型實驗結果顯示,低氧對照組的RVSP、RVHI明顯高于常氧對照組,而低氧干擾組的RVSP、RVHI較低氧對照組下降。低氧對照組的WT%明顯高于常氧對照組、肺無肌小動脈的肌化程度升高,低氧干擾組與低氧對照組相比WT%降低、肺無肌小動脈的肌化程度下降。結論：低氧可誘導大鼠原代PASMCs中CapG的表達上調,抑制CapG基因后,PASMCs的遷移能力下降、細胞活性和增殖能力降低、細胞凋亡增多、細胞周期(S+G2/M)期比例下降。以慢病毒為載體,通過氣道內滴注的途徑,將干擾CapG基因表達的Lenti-CapG感染至大鼠肺組織,可以在肺組織局部高效表達慢病毒。在低氧誘導肺動脈高壓之前經氣道滴注Lenti-CapG,可以緩解肺動脈壓力的升高、肺血管的重塑以及右心室的肥厚。提示CapG有可能成為防治HPH的潛在靶標。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R544.1

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