【摘要】：研究背景及目的:既往研究表明,血管內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化(AS)形成的起始因素,其修復有利于延緩AS的進展,因此,如何有效地修復受損的血管內(nèi)皮便成了 AS防治研究的焦點。內(nèi)皮祖細胞(EPCs)具有分化為內(nèi)皮細胞(ECs),促進血管形成的能力,因此已經(jīng)受到人們的廣泛關(guān)注。近年來的研究發(fā)現(xiàn)雖然輸注EPCs到動物體內(nèi)可以有效延緩AS進程,但仍然存在著輸注到體內(nèi)的細胞生存能力低下的問題。AS進程受多種因素影響,其中大多數(shù)因素能夠誘導氧化應(yīng)激,而它又直接或者間接促進ECs及內(nèi)皮受損,觸發(fā)AS的發(fā)生且貫穿整個AS過程。另外有文獻報道稱氧化應(yīng)激能夠?qū)е翬PCs增殖、分化、遷移及粘附等能力的降低,促進細胞凋亡,因此提高EPCs在氧化應(yīng)激條件下的生存能力則可能為細胞療法治療AS提供一種保障。鈣庫操縱型鈣內(nèi)流(SOCE)是哺乳動物細胞尤其非興奮細胞是普遍存在的一種Ca2+內(nèi)流方式。SOCE由鈣庫操縱型Ca2+通道(SOCC)介導且在多種疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)EPCs上存在SOCE,改變SOCC的主要組成蛋白能夠影響細胞的增殖、分化、遷移及粘附等功能。但是SOCE是否參與氧化應(yīng)激誘導的EPCs損傷尚未見報道,另外越來越多的證據(jù)表明胞內(nèi)Ca2+濃度和Ca2+信號通路與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。因此,本研究擬利用過氧化氫(H202)作為氧化應(yīng)激的誘導劑處理EPCs,探索SOCE在氧化應(yīng)激誘導的EPCs損傷中可能發(fā)揮的作用以及相關(guān)機制,并嘗試尋找減緩甚至逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激誘導EPCs損傷的靶點及策略。方法:1. H2O2對EPCs細胞活性、細胞凋亡的影響1.1 EPCs的分離接種、培養(yǎng)及鑒定取雄性SD大鼠,150-180 g,腹腔注射過量的戊巴比妥鈉(100 μg/kg)處死,經(jīng)碘伏消毒后解剖取脾臟,接著梯度離心法分離獲取單個核細胞并接種至低糖型培養(yǎng)基中。以培養(yǎng)內(nèi)皮細胞的條件培養(yǎng)至7天,培養(yǎng)過程中用顯微鏡觀察細胞貼壁情況及細胞形態(tài)變化,符合EPCs特征并用DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-I熒光雙吞法檢測細胞是否具備EC特性。1.2 H2O2對細胞活性的影響EPCs培養(yǎng)7天,用胰蛋白酶消化后接種至96孔板,待細胞貼壁后H202處理,cck8檢測細胞活性。1.3 H2O2對細胞凋亡的影響EPCs培養(yǎng)7天,H2O2處理細胞,凋亡相關(guān)試劑染色后上流式細胞儀檢測EPCs凋亡情況。2. H2O2對胞內(nèi)Ca2+流、SOCE及SOCC復合體的影響2.1 H2O2對胞內(nèi)鈣流的影響2.1.1 EPCs培養(yǎng)7天,避光孵育Fluo-3AM,H202處理后觀察細胞內(nèi)鈣流變化。2.1.2 EPCs培養(yǎng)7天,Ca2+螯合劑(BAPTA)預處理,H2O2處理后cck-8及凋亡試劑盒分別檢測細胞活性和細胞凋亡情況。2.2 H2O2對SOCE的影響EPCs培養(yǎng)7天,為了探討H2O2誘導的胞內(nèi)Ca2+濃度變化是否由SOCE引起的,避光孵育Fluo-3AM,觀察無細胞外Ca2+存在情況下,H202和毒胡蘿卜素(TG)處理,激光共聚焦顯微鏡下觀察此時及Ca2+濃度回落后加入CaCl2溶液細胞內(nèi)鈣流變化。2.3 H2O2對SOCC復合體的影響2.3.1 EPCs培養(yǎng)7天,提取總RNA,半定量PCR觀察SOCC復合體主要組成成分(Orai1、Stim1、Trpc1)轉(zhuǎn)錄水平的變化。2.3.2 EPCs培養(yǎng)7天,提取總蛋白,BCA法測量蛋白濃度,Western blot檢測翻譯水平SOCC復合體主要組成蛋白(Orai1、Stim1、Trpc1)的改變。2.4抑制SOCE后觀察H202對胞內(nèi)鈣濃度的影響2.4.1 shRNA干擾Stim1的表達EPCs培養(yǎng)5天,貼壁好,融合度大約30-50%,用攜帶shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染2天,熒光顯微鏡觀察并用免疫印跡法分析干擾效度。2.4.2抑制SOCE對H202誘導的鈣內(nèi)流的影響藥物抑制及shRNA干擾EPCs后,孵育裝載Fluo-3AM, HBSS溶液洗去培養(yǎng)液中殘留的Fluo-3AM, H202處理并在顯微鏡下觀察Ca2+實時變化情況。3. H2O2增強SOCE對細胞活性及凋亡的影響SOCE抑制劑抑制及shStim1干擾EPCs來抑制SOCE, H2O2處理細胞后分別用cck-8和凋亡試劑盒檢測細胞活性及凋亡情況。4. H2O2通過SOCE引起細胞凋亡機制的探討4.1抑制SOCE對胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的影響培養(yǎng)EPCs,ML-9預處理或shRNA干擾抑制SOCE后加H2O2處理6小時,對比觀察細胞凋亡情況。4.2抑制SOCE對caspase家族的影響培養(yǎng)EPCs 7天,H2O2處理并用免疫印跡法分析其對caspase家族蛋白的表達情況的影響,針對有明顯變化的caspase家族蛋白,抑制SOCE后觀察H202處理對蛋白表達的影響。4.3抑制SOCE對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平及線粒體損傷水平的影響觀察發(fā)現(xiàn)H2O2處理EPCs能夠顯著上調(diào)caspase9和caspase12蛋白的表達水平,這說明H2O2處理可能觸發(fā)了與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體功能紊亂相關(guān)的凋亡途徑,為了進一步證實這一推論,用H202處理EPCs,免疫印跡法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性表達蛋白CHOP、BIP及線粒體功能紊亂標志蛋白cytochrome C的表達變化,并觀察線粒體膜電位變化情況。以及抑制SOCE后加H202處理同樣檢測這些指標,觀察其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平及線粒體損傷水平的影響。結(jié)果:1. H2O2對EPCs細胞活性、細胞凋亡的影響1.1 EPCs的分離接種、培養(yǎng)及鑒定分離獲取脾源性EPCs并接種至低糖型培養(yǎng)基上,期間在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)貼壁細胞逐漸增大變變圓,最終呈現(xiàn)梭狀、紡錘狀、樹突狀等各種形狀。熒光雙吞法鑒定顯示,DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-I雙陽性的細胞大概有85%,這些即為EPCs。1.2 H202對細胞活性的影響不同濃度H202處理EPCs 6小時,cck-8檢測細胞活性顯示200μM H2O2時細胞活性顯著降低(p0.05),600μM時細胞活性接近50%。用600μM H202處理不同時間發(fā)現(xiàn)1小時后細胞活性明顯降低(p0.05),6小時時細胞活性降至50%左右。因此600μM H2O2處理6小時作為后續(xù)實驗的實驗條件。1.3 H2O2對細胞凋亡的影響600μM H2O2處理EPCs 6小時,凋亡試劑盒檢測細胞凋亡顯示,細胞凋亡明顯增加(p0.05),而且對照組和H2O2處理組細胞凋亡率分別為5.30%和40.65%。2. H2O2對胞內(nèi)Ca2+流、SOCE及SOCC復合體的影響2.1 H2O2對胞內(nèi)鈣流的影響2.1.1EPCs培養(yǎng)7天,避光孵育Fluo-3AM,600μM H2O2處理并在激光共聚焦顯微鏡下觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),加入H2O2后胞內(nèi)Ca2+濃度迅速升高。2.1.2為了進一步探討H2O2、Ca2+濃度與細胞活性及凋亡的關(guān)系,首先利用胞內(nèi)Ca2+螯合劑(BAPTA)預處理EPCs,再用600μM H2O2處理6小時,cck-8檢測發(fā)現(xiàn)可以顯著減緩H2O2造成的EPCs活性的降低(p0.05),與此同時,流式細胞儀檢測結(jié)果表明H2O2造成的EPCs凋亡增加的狀況也得到顯著改善(p0.05)。2.2 H2O2對SOCE的影響為了探討H2O2是否通過SOCE誘導胞內(nèi)Ca2+的改變,避光孵育Fluo-3AM后,HBSS溶液洗脫細胞外Ca2+,H2O2和TG處理EPCs發(fā)現(xiàn)H2O2處理與TG 一樣能夠誘導典型的鈣釋放激活鈣內(nèi)流的過程。2.3 H2O2對SOCC復合體的影響實驗表明H2O2處理能夠引起SOCE的變化,為了進一步探討H2O2引起SOCE改變的機制,我們分別在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平檢測SOCC復合體組成成分(Orail、Stim1、Trpc1)的改變,結(jié)果顯示與對照組相比轉(zhuǎn)錄水平Orail下調(diào)、Stim1上調(diào)、Trpc1下調(diào),翻譯水平 Orail下調(diào) 39.77% (p0.05)、Stim1 上調(diào) 122.03% (p0.05)、Trpc1 無明顯變化(p0.05)。2.4抑制SOCE后觀察H2O2對胞內(nèi)鈣濃度的影響2.4.1針對H2O2引起改變的SOCC復合體主要組成成分,選取干擾Stim1來特異性抑制SOCE,熒光顯微鏡下觀察近一半細胞攜帶熒光,免疫印跡法結(jié)果表明ShRNA干擾能夠下調(diào)Stim1蛋白表達達30.15% (p0.05)。2.4.2 SOCE抑制劑(ML-9)預處理及ShRNA干擾Stim1后,600μM H2O2處理6小時觀察EPCs胞內(nèi)Ca2+濃度變化,結(jié)果顯示抑制SOCE能夠明顯降低H2O2誘導的胞內(nèi)Ca2+濃度升高。3. H2O2增強SOCE對細胞活性及凋亡的影響抑制SOCE后600 μ M H2O2處理6小時cck-8檢測細胞活性及凋亡試劑盒檢測凋亡發(fā)現(xiàn),與H2O2組相比ML-9組和ShRNA干擾組細胞活性分別升高20.04% (p0.05)和27.68% (p0.05),細胞凋亡分別降低 16.45% (p0.05)和 23.34% (p0.05)。4.H2O2通過SOCE引起細胞凋亡機制的探討4.1抑制SOCE對胞內(nèi)ROS水平的影響600μMH2O2處理6小時,胞內(nèi)ROS水平明顯升高(p0.05),而用胞內(nèi)ROS清除劑預處理組則細胞凋亡減少18.549% (p0.05),說明ROS水平的升高會導致細胞凋亡增加,那么抑制SOCE所減緩的H2O2誘導的細胞凋亡是否跟胞內(nèi)ROS水平相關(guān)呢?進一步我們抑制SOCE發(fā)現(xiàn)抑制SOCE可以明顯降低H2O2誘導的胞內(nèi)ROS水平的升高(p0.05)。4.2抑制SOCE對caspase家族的影響為了探索H2O2通過SOCE誘導細胞凋亡的機制,首先檢測H202對caspase家族的影響,結(jié)果顯示它可以明顯促進caspase家族成員9和12表達的上調(diào)(p0.05)。4.3抑制SOCE對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平及線粒體損傷水平的影響600 μM H2O2處理6小時,能夠明顯上調(diào)caspase家族成員9和12的蛋白表達水平,說明H202處理可能激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑和線粒體損傷凋亡途徑,為了進一步證實這一推論,我們檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體損傷相關(guān)指標,結(jié)果顯示H2O2明顯上調(diào)CHOP、BIP及cytochrome C的表達(p0.05),降低線粒體膜電位(p0.05),說明H2O2上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平及線粒體損傷水平。而抑制SOCE可以明顯降低H2O2誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平及線粒體損傷水平的升高(p0.05)。結(jié)論:1. H2O2促進EPCs細胞活性的降低及細胞凋亡的增加。2. H2O2促進EPCs上SOCE的增強。3. H2O2部分通過上調(diào)Stim1的表達增強SOCE。4. H2O2通過增強SOCE促進EPCs細胞活性的降低及細胞凋亡的增加。5. H2O2通過增強SOCE激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑及線粒體損傷凋亡途徑。6.抑制SOCE明顯改善氧化應(yīng)激誘導的EPCs細胞活性降低及凋亡增加的狀況,因此,SOCE可能成為提高EPCs在氧化應(yīng)激條件下生存能力和預防及治療AS的有效靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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本文編號：2410916