【摘要】：缺血性心臟病(ischemic heart disease,IHD)的臨床治療主要是通過(guò)恢復(fù)缺血部位的血流灌注,但卻可能會(huì)對(duì)心肌組織造成更嚴(yán)重的損傷,即缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷。細(xì)胞內(nèi)鈣超載是心肌功能異常與I/R損傷的主要誘因。缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning,IPC)是機(jī)體固有的一種強(qiáng)有力的內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象,指心肌經(jīng)歷反復(fù)短暫的亞致死性I/R損傷后,能夠顯著增強(qiáng)對(duì)隨后長(zhǎng)時(shí)間的嚴(yán)重缺血損傷耐受性的現(xiàn)象。IPC的保護(hù)作用同樣存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞上,血管內(nèi)皮細(xì)胞在血液和組織器官界面之間充當(dāng)了重要的屏障,是心肌I/R損傷發(fā)生時(shí)的第一道防線。因此,研究IPC作用保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的健康完整可能有助于預(yù)防或減輕心肌細(xì)胞的缺血、I/R損傷。細(xì)胞微囊泡(microvesicles,MVs)是細(xì)胞發(fā)生激活或凋亡時(shí)產(chǎn)生釋放到細(xì)胞外的一種膜性囊泡樣物質(zhì),能通過(guò)攜帶生物活性物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)各種生命活動(dòng)。那么IPC對(duì)心肌I/R損傷的有效保護(hù)能否通過(guò)釋放保護(hù)性的MVs來(lái)介導(dǎo)呢?本實(shí)驗(yàn)利用體外缺氧預(yù)處理(hypoxia preconditioning,HPC)模擬體內(nèi)IPC,細(xì)胞內(nèi)鈣超載損傷代表I/R損傷,研究HPC誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)釋放的MVs對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣超載損傷H9c2心肌細(xì)胞的作用。目的:體外構(gòu)建HUVECs的HPC模型,提取培養(yǎng)上清中的微囊泡(HUVECs derived microvesicles induced by hypoxia preconditioning,HPC-EMVs)。對(duì)分離得到的HPC-EMVs進(jìn)行蛋白定量和形態(tài)學(xué)鑒定,探討HPC-EMVs對(duì)正常和細(xì)胞內(nèi)鈣超載損傷H9c2心肌細(xì)胞的作用。方法:1.HUVECs細(xì)胞HPC模型的建立HUVECs以6×104的密度接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h后,隨機(jī)分為Control,H/R(hypoxia/reoxygenation)和HPC組。Control組正常培養(yǎng),H/R組行缺氧12 h,復(fù)氧4 h培養(yǎng),HPC組經(jīng)歷短期預(yù)缺氧/復(fù)氧后,再行長(zhǎng)時(shí)間缺氧12 h,復(fù)氧4 h,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,選擇適宜的細(xì)胞種板密度、預(yù)缺氧/復(fù)氧時(shí)間、預(yù)缺氧/復(fù)氧使用缺氧液的p H值,使HPC組細(xì)胞存活率顯著高于H/R組,建立HUVECs細(xì)胞的HPC模型。2.HPC-EMVs的分離提取與形態(tài)學(xué)鑒定采用超速離心的方法在HPC處理的培養(yǎng)上清液中收集HPC-EMVs,采用BCA法對(duì)HPC-EMVs進(jìn)行蛋白定量,采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。3.H9c2細(xì)胞內(nèi)鈣超載損傷模型的建立H9c2細(xì)胞以1×105個(gè)/m L密度接種于96孔板中,以不同濃度鈣離子載體離子霉素(ionomycin)誘導(dǎo)細(xì)胞損傷并觀察0.55μmol/L濃度ionomycin對(duì)H9c2細(xì)胞內(nèi)鈣超載的影響。H9c2細(xì)胞以1×105個(gè)/m L密度接種于直徑35 mm的共聚焦小皿中,隨機(jī)分組,以0.55μmol/L ionomycin避光處理50 min后,加入Fluo-3 AM熒光染料負(fù)載,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡在488 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)下攝片。利用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)化分析,確定最適宜的ionomycin處理濃度,建立H9c2細(xì)胞鈣超載損傷模型。4.HPC-EMVs對(duì)正常H9c2細(xì)胞的作用H9c2細(xì)胞分為Control組,10,30,60μg/m L HPC-EMVs處理組,共4組。Control組加入不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基;HPC-EMVs 10,30,60組分別加入10,30及60μg/m L的HPC-EMVs,共同培養(yǎng)4 h。通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。5.HPC-EMVs對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣超載H9c2細(xì)胞的作用H9c2細(xì)胞分為Control,0,10,30,60μg/m L HPC-EMVs處理組,共5組。Control組加入無(wú)FBS的DMEM培養(yǎng)基;HPC-EMVs處理組分別用0,10,30,60μg/m L HPC-EMVs預(yù)先孵育H9c2細(xì)胞4 h,再誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣超載損傷。首先Fluo-3 AM熒光染色后,利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)60μg/m L HPC-EMVs組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度,并通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,比色法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,采用Hoechst 33258染色從形態(tài)學(xué)觀察H9c2細(xì)胞凋亡,分光光度法檢測(cè)細(xì)胞中Caspase 3活性,Western blot法檢測(cè)H9c2細(xì)胞中Bcl-2/Bax的表達(dá)。結(jié)果:1.成功建立HUVECs的HPC模型HUVECs以6×104的細(xì)胞密度種板,HPC組加入p H 6.8的缺氧液,通入95%N2-5%CO2混合氣預(yù)缺氧通氣10 min/復(fù)氧15min,再加入等量p H 5.8的缺氧液,然后通混合氣平衡15min,缺氧12 h,復(fù)氧培養(yǎng)4 h后,與H/R組相比,HPC組存活率顯著升高(93.9±6.9%vs 79.6±5.7%,P0.01),且模型穩(wěn)定易操作,重復(fù)性較好。2.成功分離提取得到HPC-EMVs并進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)2,700 g,4℃,離心20 min除去細(xì)胞碎片,采用33,000 rpm,148 min,4℃超速離心得到HPC-EMVs。重懸后,HPC-EMVs蛋白定量結(jié)果為0.304±0.06μg/μL。透射電子顯微鏡觀察到HPC-EMVs為直徑100-1000 nm的膜性囊泡樣結(jié)構(gòu),呈圓或橢圓形,有完整的包膜,單個(gè)分散或聚集成群。3.成功建立H9c2細(xì)胞內(nèi)鈣超載損傷模型與Control組相比,0.55μmol/L ionomycin能顯著降低H9c2的存活率(63.2±4.7%vs 100±0%,P0.001)。選擇0.55μmol/L ionomycin驗(yàn)證鈣超載。與Control組相比,0.55μmol/L ionomycin作用H9c2細(xì)胞50 min,細(xì)胞內(nèi)鈣離子平均熒光強(qiáng)度有顯著升高(38.57±0.83 a.u.vs 24.28±0.90 a.u.,P0.001)。4.HPC-EMVs對(duì)正常H9c2細(xì)胞的作用與Control組相比,10μg/m L HPC-EMVs對(duì)正常H9c2細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響(97.3±2.8%vs 100±0%),30,60μg/m L HPC-EMVs對(duì)正常H9c2細(xì)胞存活率有顯著降低(91.9±1.4%,77.4±3.1%vs 100±0%,P0.001),且作用呈劑量依賴性。5.HPC-EMVs對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣超載損傷H9c2細(xì)胞的作用激光共聚焦顯微鏡攝片顯示,與HPC-EMVs 0組相比,60μg/m L HPC-EMVs能顯著降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度(30.96±1.19 a.u.vs 38.57±0.83 a.u.,P0.001),減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載。采用ionomycin造成H9c2細(xì)胞內(nèi)鈣超載,與HPC-EMVs 0組相比,10μg/m L HPC-EMVs對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響(61.7±4.4%vs 63.2±4.7%),30,60μg/m L HPC-EMVs使細(xì)胞存活率顯著升高(70.3±4.3%,74.4±5.6%vs 63.2±4.7%,P0.001)。HPC-EMVs 30和60組LDH漏出顯著減少(157.24±16.51 U/L,145.01±5.86 U/L vs 178.93±12.86 U/L,P0.05,P0.001)。Hoechst 33258染色結(jié)果觀察到,HPC-EMVs處理組內(nèi),隨HPC-EMVs濃度增加,細(xì)胞碎裂情況減少,核凝聚減輕。HPC-EMVs 30,60組Caspase 3活性顯著降低(314.27±9.53 U/μg,304.25±10.49 U/μg vs 365.44±9.54 U/μg,P0.001),而HPC-EMVs 10組略有降低但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(354.97±10.48 U/μg vs 365.44±9.54 U/μg)。Western blot結(jié)果顯示,隨HPC-EMVs濃度的增加,各組Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸增多,Bax蛋白表達(dá)逐漸減少,兩者比值升高,其中HPC-EMVs 60組Bcl-2/Bax顯著升高。結(jié)論:1.本實(shí)驗(yàn)成功建立了HUVECs的HPC模型。2.透射電鏡觀察超速離心得到沉淀物為直徑100-1000 nm的膜性囊泡樣結(jié)構(gòu),證實(shí)利用HPC處理HUVECs分離提取得到的膜性囊泡樣物質(zhì)確為HPC-EMVs。3.成功建立H9c2細(xì)胞內(nèi)鈣超載損傷模型。0.55μmol/L ionomycin能誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞內(nèi)鈣離子平均熒光強(qiáng)度顯著升高,且細(xì)胞損傷程度適中。4.30,60μg/m L HPC-EMVs對(duì)正常H9c2細(xì)胞存活產(chǎn)生影響,降低H9c2細(xì)胞存活率,其中以60μg/m L HPC-EMVs作用最顯著。5.60μg/m L HPC-EMVs能顯著減輕H9c2細(xì)胞內(nèi)鈣超載。對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣超載的H9c2細(xì)胞,30,60μg/m L HPC-EMVs使細(xì)胞存活率顯著升高;LDH漏出明顯減少,Caspase 3活性顯著降低。Hoechst 33258染色觀察到HPC-EMVs能劑量依賴性的減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載H9c2細(xì)胞核碎裂和核聚集。60μg/m L HPC-EMVs能顯著增加細(xì)胞內(nèi)鈣超載H9c2細(xì)胞Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2408587