【摘要】：研究背景動(dòng)脈粥樣硬化是誘發(fā)心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ),巨噬泡沫細(xì)胞的形成是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病早期典型的病理改變。最新研究證實(shí),巨噬細(xì)胞的自噬溶酶體活性與膽固醇代謝狀況以及泡沫細(xì)胞的形成密切相關(guān)。因此,調(diào)控巨噬細(xì)胞的自噬過程,減少巨噬泡沫細(xì)胞的形成,成為治療動(dòng)脈粥樣硬化及相關(guān)疾病的核心。近年來,SUMO(small ubiquitin-related modifier)化修飾作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程,參與胚胎發(fā)生發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生理病理過程,已成為近年來研究的熱點(diǎn)。我們前期研究證實(shí)調(diào)控自噬溶酶體生成最重要的轉(zhuǎn)錄因子TFEB(transcription factor EB)能夠發(fā)生SUMO化修飾,因此,我們推測TFEB的SUMO化修飾通過調(diào)控自噬溶酶體生成參與了巨噬泡沫細(xì)胞的形成。目的本研究通過觀察TFEB的SUMO化修飾對巨噬細(xì)胞自噬體溶酶體生成的影響,深入探討其在動(dòng)脈粥樣硬化巨噬泡沫細(xì)胞形成過程中的作用及機(jī)制。這些研究將有助于進(jìn)一步了解蛋白質(zhì)SUMO化修飾及其調(diào)控的生物學(xué)功能,并進(jìn)一步了解巨噬泡沫細(xì)胞形成的機(jī)理及在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中的作用。方法一、培養(yǎng)THP-1巨噬細(xì)胞,給予氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)處理24h,應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞TFEB的SUMO化修飾水平的變化。二、運(yùn)用慢病毒技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)人TFEB(TFEB)和SUMO化位點(diǎn)突變的TFEB THP-1(TFEB K316R)巨噬細(xì)胞株,以空載病毒細(xì)胞作為陰性對照組,應(yīng)用電鏡技術(shù)觀察各組巨噬細(xì)胞自噬生成情況;應(yīng)用免疫熒光技術(shù)及western blot檢測各組巨噬細(xì)胞自噬生成標(biāo)志lc3的表達(dá)情況。三、培養(yǎng)過表達(dá)tfeb和sumo化位點(diǎn)突變的tfeb巨噬細(xì)胞,以空載病毒細(xì)胞作為陰性對照組,應(yīng)用電鏡技術(shù)及l(fā)ysotracker染色觀察各組巨噬細(xì)胞溶酶體生成情況;應(yīng)用免疫熒光技術(shù)及westernblot檢測各組巨噬細(xì)胞中溶酶體生成標(biāo)志lamp1的表達(dá)情況。四、培養(yǎng)過表達(dá)tfeb和sumo化位點(diǎn)突變的tfeb巨噬細(xì)胞,以空載病毒細(xì)胞作為陰性對照組,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量pcr的方法檢測各組巨噬細(xì)胞tfeb下游靶基因(自噬及溶酶體生成相關(guān)基因)的表達(dá)情況。五、培養(yǎng)過表達(dá)tfeb和sumo化位點(diǎn)突變的tfeb巨噬細(xì)胞,以空載病毒細(xì)胞作為陰性對照組,給予ox-ldl處理24h,通過熒光分光光度計(jì)檢測各組巨噬細(xì)胞總膽固醇(tc)、膽固醇酯(ce)含量及膽固醇酯水解率;用液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測各組巨噬細(xì)胞膽固醇流出率;六、培養(yǎng)過表達(dá)tfeb和sumo化位點(diǎn)突變的tfeb巨噬細(xì)胞,以空載病毒細(xì)胞作為陰性對照組,給予ox-ldl處理24h,應(yīng)用油紅o及nilered染色觀察各組巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞形成情況。結(jié)果一、在巨噬泡沫細(xì)胞形成過程中,tfeb的sumo化修飾水平的改變培養(yǎng)人thp-1巨噬細(xì)胞,我們檢測到了內(nèi)源性tfeb的sumo化修飾條帶。并且,給予50μg/mlox-ldl刺激24h后,發(fā)現(xiàn)tfeb的sumo化修飾水平較對照組明顯降低,說明在ox-ldl誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化過程中,tfeb的sumo化修飾水平受到顯著抑制。二、tfeb的sumo化修飾對巨噬細(xì)胞自噬的影響電鏡結(jié)果顯示:與對照組相比,tfeb組巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量明顯增加,而tfebk316r組巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量明顯較tfeb組顯著減少(均p0.05)。并且,tfeb組巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬生成標(biāo)志lc3的蛋白表達(dá)量較tfebk316r組顯著明顯增加。這些結(jié)果說明tfeb的sumo化修飾促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬。三、tfeb的sumo化修飾對巨噬細(xì)胞溶酶體生成的影響電鏡和lysotracker染色結(jié)果顯示:與對照組相比,tfeb組巨噬細(xì)胞溶酶體數(shù)量增多(p0.05),體積增大;而tfebk316r組巨噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體數(shù)量和體積較對照組無明顯差異。并且,tfeb組巨噬細(xì)胞溶酶體生成標(biāo)志lamp1的蛋白表達(dá)量較tfebk316r組明顯增加。這些結(jié)果說明tfeb的sumo化修飾促進(jìn)巨噬細(xì)胞溶酶體的生成。四、tfeb的sumo化修飾對tfeb下游自噬及溶酶體生成基因表達(dá)的影響與對照組相比,過表達(dá)tfeb明顯增加巨噬細(xì)胞自噬(lc3,ulk1,wip1,atg9b,becline1)和溶酶體(lamp1,ctsb,clcn7,atp6v1a)生成相關(guān)基因的表達(dá),但是tfebk316r組內(nèi)自噬溶酶體生成相關(guān)基因的表達(dá)量較tfeb組明顯降低(均p0.05)。這些結(jié)果說明tfeb的sumo化修飾促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬及溶酶體生成相關(guān)基因的表達(dá)。五、tfeb的sumo化修飾對巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇流出的影響與對照組相比,tfeb組巨噬細(xì)胞內(nèi)tc和ce含量明顯降低,膽固醇酯水解程度顯著增加,apoa-i介導(dǎo)的膽固醇流出增多(均p0.05);而tfebk316r組巨噬細(xì)胞內(nèi)tc和ce含量較tfeb組明顯增加,膽固醇酯水解程度顯著降低,apoa-i介導(dǎo)的膽固醇流出減少(均p0.05)。這些結(jié)果說明tfeb的sumo化修飾促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的水解,增加膽固醇的流出。六、tfeb的sumo化修飾對巨噬泡沫細(xì)胞形成的影響油紅o及nilered染色結(jié)果顯示:與對照組相比,tfeb組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴聚集及泡沫細(xì)胞形成明顯減少;而tfebk316r組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴聚集及泡沫細(xì)胞形成較tfeb組顯著增多,這些結(jié)果說明,tfeb的sumo化修飾抑制了巨噬泡沫細(xì)胞的形成。結(jié)論一、在ox-ldl誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化過程中,tfeb的sumo化修飾水平明顯降低,初步明確tfeb的sumo化修飾與巨噬泡沫細(xì)胞形成的關(guān)系。二、TFEB的SUMO化修飾通過增加自噬與溶酶體生成相關(guān)基因的表達(dá),誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞溶酶體的生成和自噬過程。三、TFEB的SUMO化修飾通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)水解,促進(jìn)膽固醇的流出,最終減少泡沫細(xì)胞的形成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R543.5

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4 夏敏,侯孟君,唐志紅,朱惠蓮,馬靜,凌文華;花青素對小鼠巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇外流的影響[J];中國病理生理雜志;2005年05期

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本文編號(hào)：2408611