【摘要】：1.孕期脂多糖暴露對子代大鼠腎臟多巴胺D1受體介導(dǎo)的尿鈉排泄的影響及機制研究1.1研究背景及目的高血壓是心血管病重要危險因素,其發(fā)病機制復(fù)雜。既往認為,基因與環(huán)境之間均在其中發(fā)揮了重要的作用。近年來,大量研究表明,孕期不良因素也是高血壓發(fā)生發(fā)展的重要原因之一,并逐漸形成了“人類健康與疾病的發(fā)育起源”學(xué)說。該學(xué)說創(chuàng)始人David Barker及其同事認為,如果胚胎在發(fā)育的關(guān)鍵階段遭遇不良因素干擾將會對子代機體結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生長遠影響。母體感染與炎癥是孕期常見的并發(fā)癥之一。大量流行病學(xué)調(diào)查顯示,孕期感染往往與一些出生后不良事件相關(guān)。宮內(nèi)感染已被認為是胎兒不良因素的重要來源,LPS是格蘭陰性菌胞壁的重要成分,并且存在于人體消化道。通過腹腔注射LPS可以較好地模擬孕期感染模型。母體LPS暴露后可以導(dǎo)致機體、胎盤、羊水、胎兒等產(chǎn)生炎癥因子,IL-1,IL-6和TNF-α等,并影響胚胎發(fā)育。既往研究顯示,孕期LPS暴露可引起子代血壓升高。眾所周知,血壓升高不僅僅是促高血壓因素增強的結(jié)果,抗高血壓因素功能降低也在其中發(fā)揮重要的作用,如:腎臟多巴胺能系統(tǒng)即是眾多的抗血壓作用因素之一。腎臟可以產(chǎn)生多巴胺,并已被認為是高血壓發(fā)生發(fā)展及血壓調(diào)控的重要因素。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能,多巴胺受體可以分成D1-(D1R,D5R)和D2-(D2R,D3R和D4R)兩大類共5種亞型。在機體鈉鹽負荷增加時,腎臟多巴胺可以通過D1類受體發(fā)揮顯著的促尿鈉排泄作用,并保持血壓穩(wěn)定。在高血壓患者、鹽敏感性高血壓及遺傳性高血壓動物模型常伴有多巴胺功能異常。之前的研究表明,腎臟D1R功能紊亂主要由其磷酸化水平升高導(dǎo)致,而后者則由腎臟GRK2、GRK4表達及活性升高引起。研究表明,氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致腎臟GRK2、GRK4表達及活性顯著升高。通過抗氧化劑TEMPOL干預(yù),可以降低體內(nèi)氧化應(yīng)激水平,恢復(fù)D1R磷酸化和表達水平,以及血壓。因此,我們將探討孕期LPS暴露對子代大鼠腎臟多巴胺D1R介導(dǎo)的尿鈉排泄功能的影響,以及通過抗氧化干預(yù)是否可以恢復(fù)d1r功能。1.2研究方法成年受孕sd大鼠在孕期第8,10,12天腹腔注射脂多糖注射液(0.79mg/kg),對照組注射等容積生理鹽水(0.5ml)。子代大鼠出生后使用尾動脈無創(chuàng)血壓測量法監(jiān)測血壓,并在第12周時分別給予抗氧化劑(tempol,1.0mmol/l飲水)干預(yù)3周。分別檢測以下指標:1.2.1子代大鼠出生后5周、3月、6月、9月、12月時鼠尾血壓及兩組間血壓差值。1.2.2分別用he染色劑masson三色法檢測腎臟形態(tài)學(xué)改變。1.2.3檢測兩組大鼠基礎(chǔ)狀態(tài)下24小時尿量、總尿鈉排泄及血壓。1.2.4子代大鼠氧化應(yīng)激檢測,尿液mda,血漿sod,腎臟sod及gsh水平。1.2.5子代大鼠腎臟多巴胺d1r介導(dǎo)的尿流速及尿鈉排泄率。1.2.6子代大鼠腎臟grk2,grk4,d1r蛋白表達水平。1.2.7子代大鼠腎臟d1r磷酸化水平。1.3研究結(jié)果1.3.1孕期lps暴露引起子代大鼠出生后血壓連續(xù)性升高。1.3.2孕期lps暴露引起子代大鼠基礎(chǔ)狀態(tài)下24小時總尿量及總尿鈉排泄降低。1.3.3孕期lps暴露導(dǎo)致子代大鼠腎臟d1r介導(dǎo)的尿鈉排泄功能受損,d1r蛋白表達降低,磷酸化升高。1.3.4孕期lps暴露子代大鼠腎臟d1r重要調(diào)節(jié)激酶grk2、grk4表達升高。1.3.5lps組子代大鼠腎臟氧化應(yīng)激指標升高,如尿液丙二醛水平(mda);抗氧化指標降低,如血漿及腎臟超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽(gsh)含量。1.3.6通過抗氧化干預(yù)可以顯著改善氧化與抗氧化狀態(tài),恢復(fù)grk4、d1r蛋白表達,降低d1r磷酸化水平,并進一步改善d1r介導(dǎo)的尿鈉排泄功能及血壓。1.4研究結(jié)論孕期脂多糖暴露可以通過ros途徑導(dǎo)致子代大鼠腎臟grk2、grk4表達升高,進一步導(dǎo)致d1r過度磷酸化及其介導(dǎo)的尿鈉排泄功能障礙,最終導(dǎo)致血壓升高。2.孕期脂多糖暴露對子代大鼠腸系膜動脈血管功能的影響及機制研究2.1研究背景及目的我們之前的研究發(fā)現(xiàn),孕期lps暴露導(dǎo)致子代大鼠腎臟多巴胺受體d1r介導(dǎo)的尿鈉排泄功能受損。另外,有研究報道,孕期lps暴露引起子代大鼠腎臟血管緊張素受體1型及2型比例(at1r/at2r)失衡,并通過激活核轉(zhuǎn)錄因子-κb(nf-κb)以及降低胸主動脈縫隙連接蛋白37表達引起子代大鼠血管功能障礙及血壓升高,但是對血管功能并無研究。由于胸主動脈是容量血管,在血壓形成中發(fā)揮的作用較為有限,研究阻力血管功能,如腸系膜動脈,對研究子代大鼠血壓形成具有重要意義。大量研究表明,血管內(nèi)皮功能在血壓調(diào)節(jié)中具有重要作用,內(nèi)皮依賴性舒張功能降低是高血壓形成的重要原因。血管內(nèi)皮細胞可以釋放多種血管活性物質(zhì),如:內(nèi)皮源性舒張因子no。no可通過彌散進入平滑肌細胞,刺激鳥苷酸環(huán)化酶活性,導(dǎo)致cgmp含量增加,從而舒張血管。因此,腸系膜動脈no-cgmp信號通路受損在高血壓發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。因此,我們的研究主要探索孕期lps暴露是否對子代大鼠腸系膜動脈no-cgmp通路造成影響及其可能的機制,并進一步探索如何恢復(fù)受損的血管功能及降低血壓,為闡明胎兒程控性高血壓的發(fā)生機理提供指導(dǎo)。2.2研究方法成年受孕sd大鼠在孕期第8,10,12天腹腔注射脂多糖注射液(0.79mg/kg),對照組注射等容積生理鹽水(0.5ml),子代大鼠出生后使用尾動脈無創(chuàng)血壓監(jiān)測法每兩周檢測一次血壓,并在第15周時分別檢測基礎(chǔ)狀態(tài)下及給予抗氧化劑(tempol,1mmol/l飲水)干預(yù)3周后子代大鼠血管功能。分別檢測以下指標:2.2.1腸系膜動脈組織形態(tài)學(xué)改變。1.2.2腸系膜動脈基礎(chǔ)狀態(tài)下及孵育一氧化氮合酶阻斷劑l-name(10-4mol/l)或鳥苷酸環(huán)化酶(gc)抑制劑odq(10-5mol/l)后對苯腎上腺素(phenylephrine,pe)介導(dǎo)的收縮反應(yīng)性。2.2.3腸系膜動脈去內(nèi)皮前、后對pe介導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)性。2.2.4腸系膜動脈基礎(chǔ)狀態(tài)下及孵育一氧化氮合酶阻斷劑l-name(10-4mol/l)或鳥苷酸環(huán)化酶(gc)抑制劑odq(10-5mol/l)后對乙酰膽堿(acetylcholine,ach)介導(dǎo)的舒張反應(yīng)性。2.2.5腸系膜動脈去內(nèi)皮后對硝普鈉(snp)介導(dǎo)的內(nèi)皮非依賴性血管舒張。2.2.6腸系膜動脈enos及gc蛋白表達,完整血管內(nèi)皮下ach刺激后no生成反應(yīng)性以及去內(nèi)皮后snp刺激下cgmp生成反應(yīng)性。2.2.7腸系膜阻力動脈超氧陰離子(dhe)水平及基礎(chǔ)狀態(tài)下angⅡ含量。2.2.8通過westernblot檢測腸系膜動脈enos、sgc、at1r、nox2、nox4、nitrotyrosine、SOD1和SOD2蛋白表達水平。2.3研究結(jié)果2.3.1孕期脂多糖暴露組子代大鼠血壓自出生后第5周起顯著高于對照組,并持續(xù)到觀察期第19周。2.3.2孕期LPS暴露的子代大鼠出生后第15周時,其完整內(nèi)皮下由Ach介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張功能降低,PE介導(dǎo)的血管收縮功能增強。2.3.3孕期LPS暴露的子代大鼠腸系膜血管內(nèi)皮去除后,由PE介導(dǎo)的腸系膜動脈收縮較對照組顯著減弱。2.3.4預(yù)先孵育一氧化氮合酶抑制劑L-NAME阻斷內(nèi)皮一氧化氮合酶(e NOS)活性劑或鳥苷酸環(huán)化酶(GC)抑制劑ODQ阻斷平滑肌細胞c GMP合成,顯著減弱對照組子代大鼠Ach介導(dǎo)的舒張,增強PE介導(dǎo)的收縮,但在LPS子代大鼠無顯著變化。2.3.5孕期LPS暴露的子代大鼠由SNP介導(dǎo)的內(nèi)皮非依賴性舒張功能明顯降低。2.3.6孕期LPS暴露的子代大鼠血管e NOS、GC蛋白表達,NO、c GMP含量顯著降低,氧化應(yīng)激水平增加(DHE、AT1R、NOX2、NOX4、nitrotyrosine),抗氧化能力降低(SOD1、SOD2)。2.3.7通過給予抗氧化劑TEMPOL干預(yù)3周,可以顯著恢復(fù)LPS子代大鼠體內(nèi)氧化失衡狀態(tài),以及e NOS、GC蛋白表達和NO、cGMP含量;同時可以顯著恢復(fù)血管功能及血壓。2.4研究結(jié)論孕期脂多糖暴露可以導(dǎo)致子代大鼠出生后血壓升高,以及腸系膜血管NO-cGMP通路受損,導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性及非依賴性舒張功能障礙。另外,LPS子代大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激升高在血管功能障礙中發(fā)揮了重要作用。3.全文結(jié)論孕期脂多糖暴露可以通過氧化應(yīng)激途徑引起子代大鼠腎臟GRK4-D1R軸功能紊亂,以及腸系膜動脈NO-c GMP信號通路受損,并最終導(dǎo)致血壓升高;通過減少孕期炎癥及氧化應(yīng)激水平可能是治療胎兒程控性高血壓的靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R544.1

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本文編號：2402201