【摘要】：背景肥厚型心肌病是一類以左心室和／或右心室肥厚為主要特征的可遺傳的心肌疾病,是誘發(fā)猝死、心力衰竭和中風的重要危險因素之一�，F(xiàn)階段,關(guān)于肥厚型心肌病的分子病理生理的基礎研究仍較少,確定參與肥厚型心肌病病理發(fā)生發(fā)展的重要修飾基因?qū)﹂_展肥厚型心肌病新的治療方法至關(guān)重要。Tomoregulin-1是新近發(fā)現(xiàn)的一個生長因子,主要參與胚胎中后期發(fā)育的調(diào)控和成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的維持,在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中表達異常。Tomoregulin-1在心臟組織中亦表達,并能夠和參與心臟發(fā)育的Cripto相結(jié)合。本實驗室基因芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn),Tomoregulin-1在遺傳性肥厚型心肌病cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟組織中表達增高。但目前尚無有關(guān)Tomoregulin-1在心臟中的功能,尤其是在肥厚型心肌病中的功能研究。因此,本文旨在通過建立Tomoregulin-1沉默和Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因小鼠,分析Tomoregulin-1對肥厚型心肌病的調(diào)節(jié)作用及可能的分子機制。方法(1) Tomoregulin-1于野生型和肥厚型心肌病小鼠心臟組織中的定位和表達：免疫熒光觀察Tomoregulin-1于野生型C57BL/6J小鼠心臟組織中的定位；Western blot檢測Tomoregulin-1于野生型C57BL/6J小鼠心臟組織中的時程表達變化和Tomoregulin-1于遺傳性肥厚型心肌病(cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠)及壓力負荷致肥厚型心肌病(主動脈縮窄,thoracic aorta constriction, TAC)小鼠心臟組織中的表達變化。(2)心臟組織特異Tomoregulin-1沉默C57BL/6J小鼠和Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠的建立：分別將靶向Tomoregulin-1基因的siRNA和鼠源Tomoregulin-1基因插入α-MHC啟動子下游,構(gòu)建表達載體,通過顯微注射法建立心臟組織特異Tomoregulin-1沉默C57BL/6J小鼠和Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠。PCR鑒定Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型,Western blot檢測Tomoregulin-1的表達,分別篩選Tomoregulin-1沉默和Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因首建鼠進行繁殖培育,穩(wěn)定傳代后,子代小鼠用于本文實驗。(3)正常生理情況下,心臟組織特異Tomoregulin-1沉默C57BL/6J小鼠和Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠心臟形態(tài)和功能的表型分析：M型超聲心動圖于1、3、5和7月齡檢測同窩陰性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因小鼠正常生理情況下心臟的結(jié)構(gòu)形態(tài)和功能。(4)壓力負荷刺激情況下,心臟組織特異Tomoregulin-1沉默C57BL/6J小鼠和Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠的表型分析與分子機制探究：于8-10周齡,分別對同窩陰性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因小鼠進行TAC,同時設假手術(shù)對照組(sham組)。于術(shù)后4周,記錄sham和TAC組中同窩陰性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因小鼠的生存狀況,M型超聲心動圖檢測小鼠心臟的結(jié)構(gòu)形態(tài)和功能變化,計算心臟重量與體重的比值評價心肌肥厚程度,病理組織學染色觀察小鼠心臟組織學改變,實時定量PCR檢測反映心肌間質(zhì)膠原成分的Ⅲ型膠原αl (Col3α1)的表達變化。Western blot檢測sham和TAC組中同窩陰性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中包括轉(zhuǎn)化生長因子2型受體(TGFβ type 2 receptor,TβR2)、轉(zhuǎn)化生長因子1型受體(TGFβ type 1 receptor, TβR2)、轉(zhuǎn)化生長因子激活激酶1(TGFβ-activated kinase 1, TAK1)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)等與心肌肥厚相關(guān)的因子的表達變化。結(jié)果(1)Tomoregulin-1定位于野生型小鼠的心肌細胞而非心臟成纖維細胞。隨著年齡的增加,Tomoregulin-1在野生型小鼠心臟組織中表達水平逐漸增高；且在遺傳性(cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠)及壓力負荷(TAC)致肥厚型心肌病小鼠模型心臟組織中表達增高。(2)分別建立了2個系的心臟組織特異的Tomoregulin-1低表達沉默小鼠和Tomoregulin-1高表達轉(zhuǎn)基因小鼠。(3)正常生理情況下,M型超聲心動圖顯示,與同窩陰性小鼠相比,心臟組織特異Tomoregulin-1沉默小鼠在1、3、5和7月齡時心臟均呈現(xiàn)室壁變薄,心腔增大,心收縮功能減退的表型：心臟組織特異Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因小鼠在5月齡之前心臟均呈現(xiàn)室壁增厚,心腔縮小,心收縮功能增強的表型,在5月齡之后,與同窩陰性小鼠相比,Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因小鼠心臟室壁增厚不明顯。(4)壓力負荷刺激情況下,生存率分析顯示,sham組的同窩陰性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因小鼠的生存率均為100%；TAC組,與同窩陰性小鼠相比,Tomoregulin-1沉默小鼠的術(shù)后4周生存率顯著降低,僅為66.7%,而Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因小鼠的生存率為84.6%,顯著高于同窩陰性小鼠。M型超聲心動圖顯示,Tomoregulin-1沉默小鼠因壓力負荷致心臟室壁增厚程度顯著高于同窩陰性小鼠,而Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因小鼠心臟室壁增厚得到明顯改善。同時,因代償增加的心收縮功能亦顯著低于同窩陰性小鼠。與同窩陰性小鼠相比,Tomoregulin-1沉默小鼠因壓力負荷致心臟重量與體重的比值顯著升高,而Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因小鼠心肌肥厚程度顯著減少。病理組織學染色可見Tomoregulin-1沉默小鼠心肌細胞排列紊亂和間質(zhì)纖維化程度均顯著高于同窩陰性小鼠,而過表達Tomoregulin-1顯著改善了壓力負荷導致的病理組織學改變。反映心肌間質(zhì)膠原成分的Col3α1在Tomoregulin-1沉默小鼠中的表達顯著增加,Col3α1的病理性增加在Tomoregulin-1過表達轉(zhuǎn)基因小鼠中得到抑制。與心肌肥厚相關(guān)的TβR1、TAK1和HNK在Tomoregulin-1沉默小鼠心臟組織中均被激活,且經(jīng)過壓力負荷病理刺激后,激活程度更加明顯；而過表達Tomoregulin-1在生理和病理情況下均可顯著抑制TβR1、TAK1和JNK的激活。結(jié)論 過表達Tomoregulin-1可顯著改善壓力負荷引起的心肌肥厚,降低Tomoregulin-1的表達可加速心肌肥厚的病理進程；心肌細胞中的TAK1-JNK信號通路參與Tomoregulin-1對壓力負荷引起的心肌肥厚的保護性調(diào)節(jié)過程。Tomoregulin-1可能是肥厚型心肌病調(diào)節(jié)的重要修飾基因,為臨床肥厚型心肌病的治療提供新的研究思路和方向。背景隨著人們生活水平的提高,物質(zhì)條件的改善,全球肥胖的患病率和發(fā)生率迅速增加,肥胖已成為全球性流行病。肥胖能引起甚多疾病,如2型糖尿病、高膽固醇血癥、高血壓或心臟病,與死亡率的增加和平均壽命的減少直接相關(guān)。人類基因組計劃的完成,大量與肥胖、糖尿病等疾病相關(guān)的基因陸續(xù)被人們發(fā)現(xiàn),瘦素受體(leptin receptor, Lepr)便是其中之一。Lepr由糖尿病(diabetes, db)基因編碼,于脈絡叢中高表達。Lepr與其配體leptin結(jié)合啟動調(diào)節(jié)攝食和機體的能量平衡。Lepr缺失或leptin缺失,均會導致肥胖的發(fā)生,并出現(xiàn)不同程度糖尿病臨床表現(xiàn)。目前,已有多種Lepr基因相關(guān)的嚙齒類動物模型應用于肥胖、糖尿病的研究,但現(xiàn)階段的動物模型均存在一定的不足,如Lepr缺失的小鼠(dbldb小鼠,C57BL/6J背景)表現(xiàn)出一過性高血糖,Lepr缺失的大鼠(Zucker大鼠,fa/fa大鼠)葡萄糖耐受受損表型出現(xiàn)遲緩等,不能完全復制人類糖尿病的所有臨床表現(xiàn)。所以,建立更理想的肥胖、糖尿病等代謝疾病的動物模型,對防治藥物的研發(fā)具有重大的臨床價值和社會意義。方法 利用常間回文重復序列叢集/常問回文重復系列叢集關(guān)聯(lián)蛋白9技術(shù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9, CRISPR/Cas9)建立Lepr基因敲除大鼠：針對Lepr基因第四個外顯子設計并合成兩個寡聚核苷酸鏈,構(gòu)建gRNA表達載體,將體外轉(zhuǎn)錄好的Cas9 mRNA(20ng/μl)和gRNA(每個gRNA10ng/μl)的混合物通過顯微注射法注入Sprague Dawley (SD)大鼠受精卵中,共產(chǎn)生8只大鼠。PCR鑒定Lepr基因敲除大鼠的基因型,TA克隆、測序進一步檢測確定Lepr敲除情況,Western blot檢測LEPR的表達,篩選Lepr基因敲除首建鼠進行繁殖培育,穩(wěn)定傳代后,子代的大鼠用于本文實驗。于1-8月齡分別檢測雄性和雌性同窩陰性大鼠和Lepr基因敲除純合子(Lepr-/-)大鼠體重、平均攝食量、空腹血糖和隨機血糖。于2、4和8月齡分別對雄性和雌性同窩陰性大鼠和Lepr-/-大鼠進行腹腔葡萄糖耐受實驗,同時測定葡萄糖刺激下的胰島素水平。于2、4和8月齡分別對雄性和雌性同窩陰性大鼠和Lepr-/-大鼠進行血生化指標測定,測定指標為：甘油三酯、總膽固醇、高密度膽固醇和低密度膽固醇。病理組織學染色觀察2、4和8月齡同窩陰性大鼠和Lepr-/-大鼠胰臟、肝臟、腎臟和脂肪組織的組織學改變。微型計算機斷層掃描分析8月齡同窩陰性大鼠和Lepr-/-大鼠的股骨遠端骨小梁結(jié)構(gòu)和骨結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù),如骨體積/全部組織體積、骨小梁的數(shù)量、骨小梁間隙、骨小梁硬度和骨密度。結(jié)果利用CRISPR/Cas9技術(shù),通過顯微注射法共產(chǎn)生8只大鼠。經(jīng)PCR鑒定、TA克隆和測序分析后,篩選出Lepr基因敲除298個堿基、插入4個堿基的2號大鼠作為首建鼠進行繁殖培育。Western blot檢測Lepr-/-大鼠肝臟中無LEPR表達。Lepr-/-大鼠于1月齡出現(xiàn)嚴重的早期肥胖,至8月齡時,雄性和雌性Lepr-/-大鼠的體重分別是同窩陰性大鼠的1.6倍和2.6倍；體重的增加伴隨著攝食量的顯著增加。雄性Lepr-/-大鼠于4月齡出現(xiàn)空腹血糖增高,并持續(xù)至8月齡；于2月齡出現(xiàn)隨機血糖增高,于4月齡達到峰值,是同窩陰性大鼠隨機血糖值的2.64倍；雌性Lepr-/-大鼠的空腹血糖和隨機血糖值均近乎正常水平。雄性Lepr-/-大鼠于2月齡出現(xiàn)明顯的葡萄糖耐受受損,隨年齡增大,受損程度逐漸增加,直至8月齡；雌性Lepr-/-大鼠僅于4月齡出現(xiàn)明顯的葡萄糖耐受受損。雄性和雌性Lepr-/-大鼠于2、4和8月齡均出現(xiàn)高胰島素血癥、高膽固醇血癥等脂質(zhì)代謝紊亂。病理組織學染色顯示,與同窩陰性大鼠相比,Lepr-/-大鼠胰島出現(xiàn)明顯的空泡、肥大、纖維化和出血；嚴重的肝臟脂肪變性；脂肪細胞體積顯著增大；腎小球基質(zhì)擴張,部分腎小球硬化,腎小管擴張和再生。8月齡的Lepr-/-大鼠,與同窩陰性大鼠相比,其股骨遠端的骨體積/全部組織體積顯著減小,骨小梁數(shù)量顯著減少,骨小梁間隙顯著增加,骨密度顯著減小。結(jié)論利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功建立Lepr基因敲除大鼠,并表現(xiàn)出明顯的肥胖、食欲過盛、血糖升高、葡萄糖耐受受損、高胰島素血癥、血脂異常和一系列糖尿病并發(fā)癥如胰腺、肝臟和腎臟的病理損傷。該敲除大鼠克服了現(xiàn)階段Lepr基因相關(guān)的嚙齒類動物模型的不足,為肥胖和糖尿病相關(guān)防治藥物的研發(fā)提供了更理想的動物模型。
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【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2
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本文編號：2400577