【摘要】：心血管系統(tǒng)疾病是威脅人類生命的主要疾病之一。心肌缺血性疾病如動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷以及心力衰竭等都有一個(gè)相同的病理改變,即在病變的區(qū)域產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS),活性氧的累積會造成心肌細(xì)胞的凋亡和壞死,進(jìn)而加速心臟疾病的病理進(jìn)程。因此,研究者們正在急切地尋求一個(gè)有效的治療手段來緩解氧化應(yīng)激對心血管系統(tǒng)的損傷。干細(xì)胞移植在缺血性心肌病的治療中具有廣泛的應(yīng)用前景,不同來源的干細(xì)胞的移植都被證實(shí)可以在不同程度上提高心功能,其中包括成體自體心臟固有的干細(xì)胞——心臟干(祖)細(xì)胞(Cardiac progenitor cells, CPCs),由于其來源于自體的組織,可以很好地避免異體移植排斥效應(yīng),因此越來越受眾多研究者關(guān)注。但是,心臟干細(xì)胞對于心肌保護(hù)的作用的機(jī)制目前還有待進(jìn)一步闡明,通常移植后干細(xì)胞的常規(guī)生理過程包括：干細(xì)胞注射到病變區(qū)域、著床、分化,然后替代損傷的心肌組織。盡管干細(xì)胞直接的分化作用和間接的旁分泌效應(yīng)都已經(jīng)被證實(shí)是干細(xì)胞心肌修復(fù)作用的潛在機(jī)制,但是近幾年來越來越多的證據(jù)顯示移植后的干細(xì)胞效應(yīng)主要來自于干細(xì)胞的旁分泌作用,干細(xì)胞可以分泌出多種旁分泌因子,這些因子在減少原有的心肌損傷和促進(jìn)受損區(qū)域細(xì)胞的修復(fù)能力等方面都具有重要作用。過去的幾年中,許多研究者證實(shí)CPCs分泌的一種名叫外泌體(exosomes)的雙層膜的納米級細(xì)胞外囊泡可以顯著改善受損心臟的心功能。Exosomes是一種直徑在30-100nm的膜性囊泡,是囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)家族的重要組成部分,可以將里面包裹的眾多轉(zhuǎn)錄因子、小非編碼RNA (microRNA, miRNAs)、長鏈非編碼(long non-coding RNA) RNA (lncRNA)等成分通過與目的細(xì)胞融合的方式傳遞到靶細(xì)胞中,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞中一些重要的信號通路。CPCs通過分泌exosomes,攜帶一些CPC中可以改善心肌損傷重要因子,傳遞到心肌細(xì)胞內(nèi),從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。但是exosomes的內(nèi)容物會根據(jù)病理?xiàng)l件的不同而發(fā)生改變,不同的因子就會導(dǎo)致靶細(xì)胞會有不同的命運(yùn)。因此,對于處在特定病理?xiàng)l件下的exosomes內(nèi)容物的探究非常必要且有意義,特別是在氧化應(yīng)激損傷的情況下,CPCs到底分泌的帶有何種因子的exosomes可以保護(hù)心肌細(xì)胞,進(jìn)而改善心功能?在exosomes所有的內(nèi)容物中,miRNAs被證實(shí)在心梗等心肌缺血性疾病中控制著某些重要的病理生理轉(zhuǎn)歸,這種單鏈的、由大約22個(gè)核苷酸組成的非編碼RNAs參與到眾多基因轉(zhuǎn)錄后翻譯的調(diào)控中。MiRNAs可以抑制或者促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡,也可以調(diào)控活性氧導(dǎo)致的心臟疾病。但是CPCs分泌的exosomes在氧化應(yīng)激的病理微環(huán)境下是否都可以保護(hù)心肌細(xì)胞?而exosomes中的miRNAs在這個(gè)過程中又發(fā)揮了怎樣的角色?因此,本研究主要探究CPCs分泌的外泌體中對于活性氧累積導(dǎo)致的心肌損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用的miRNAs以及其調(diào)控機(jī)制。研究方法：1.采用干細(xì)胞表面抗原(stem cell antigen-1, Sca-1)標(biāo)記免疫磁珠,分選帶有這種特定表型的成年小鼠的心臟干細(xì)胞,用免疫熒光鑒定其表型,流式細(xì)胞術(shù)分析分選前后Sca-1陽性的細(xì)胞比例；收集CPCs培養(yǎng)48h后的培養(yǎng)上清,用ExoQuick外泌體提取液對CPCs分泌的exosomes進(jìn)行提取,用納米粒子示蹤儀(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)對exosomes進(jìn)行粒徑分布以及濃度的分析,透射電鏡進(jìn)一步觀察exosomes的超微結(jié)構(gòu),最后用Western blot對其表面標(biāo)記(CD9、CD63、Alix)進(jìn)行定性鑒定；免疫熒光檢測H9C2細(xì)胞對膜染料PHK-26標(biāo)記后的exosomes的攝取情況；2.用過氧化氫模擬心肌受損時(shí)氧化應(yīng)激的環(huán)境,確定過氧化氫的濃度,處理CPC,NTA分析用該濃度過氧化氫處理前后分泌exosomes量的差異；選擇13個(gè)與本研究相關(guān)的miRNAs, RT-qPCR解析在exosomes里面可能包含的miRNAs,并比較氧化應(yīng)激刺激前后exosomes內(nèi)的miRNAs的差異(miR-X)；3.用RT-qPCR檢測miR-X在氧化應(yīng)激損傷的心肌細(xì)胞中表達(dá)差異,TargetScan預(yù)測差異miR-X的靶基因,轉(zhuǎn)染miR-X模擬物和抑制物Western Blot檢測靶蛋白的變化,驗(yàn)證miR-X與靶蛋白相互調(diào)節(jié)在心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致?lián)p傷的作用,采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對miR-X與靶蛋白的直接結(jié)合效應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證;4.分別用CPC共培養(yǎng)、正常exosomes和過氧化氫刺激后的exosomes預(yù)處理心肌細(xì)胞,再對心肌細(xì)胞進(jìn)行氧化應(yīng)激損傷處理,RT-qPCR檢測miR-X的改變,WB檢測細(xì)胞中miR-X的靶蛋白和凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達(dá)水平,流式細(xì)胞儀檢測Annexin V/PI雙染后處于各時(shí)期細(xì)胞的比例,反映細(xì)胞的凋亡水平。結(jié)果：1.原代培養(yǎng)的CPCs形態(tài)呈不規(guī)則的梭形,流式細(xì)胞儀對分選前后的細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記物Sca-1陽性比例的分析,結(jié)果顯示,分選后Sca-1+細(xì)胞的比例較分選前顯著增加(95.04±4.29% vs.1.31±0.42%),免疫熒光結(jié)果提示,分選后CPC幾乎全部表達(dá)分選標(biāo)記Sca-1蛋白；CPCs培養(yǎng)上清離心之后有明顯白色沉淀沉積于管底,NTA結(jié)果檢測出exosomes的粒徑分布范圍以及濃度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分粒子都處于exosomes直徑的范圍(30-100nm),含量最多的粒子直徑約為83nm,濃度為9.16×109個(gè)/m1.投射電鏡檢測到雙層膜的直徑在100nm左右的囊性小泡,進(jìn)一步用Western Blot分析該白色沉淀發(fā)現(xiàn),我們所提取出的物質(zhì)陽性表達(dá)CD63、CD9、Alix蛋白；exosomes被PKH26標(biāo)記后,與H9C2細(xì)胞中共孵育12h后,免疫熒光可見大量紅色物質(zhì)在胞漿聚集；2.隨著過氧化氫處理濃度增加,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化光,鏡下可見細(xì)胞皺縮漂浮甚至死亡,用Western Blot發(fā)現(xiàn)cleaved caspase-3表達(dá)明顯增加,100μM效果明顯,且細(xì)胞無致死性損傷,因此本研究采用100μMH2O2作為氧化應(yīng)激損傷濃度。Exosomes的NTA計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,與正常CPC (Nor-CPC)相比((1.31±0.29)×109),100μM H202可以促使CPCs (H2O2-CPC)分泌較多的exosomes((3.36±0.66)×109); qPCR結(jié)果顯示,可以在Nor-CPC的exosomes (Nor-exo)和H2O2-CPC的exosomes (H2O2-exo)成功擴(kuò)增出6個(gè)相關(guān)的miRNAs(miR-21,24,214,132,195,210),且miR-21在Nor-exo和H2O2-exo表達(dá)水平具有顯著性差異；對轉(zhuǎn)染miR-21的模擬物和抑制物后,Western blot結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-21后激活型caspase-3的表達(dá)顯著下調(diào),而抑制miR-21.的表達(dá)可顯著上調(diào)激活型caspase-3,提示miR-21在H9C2細(xì)胞中是重要的抗過氧化氫誘導(dǎo)的凋亡因子。3. Target Scan預(yù)測出,在不同種屬來源的PDCD4 mRNA的3'UTR的不同區(qū)域,都有一段相對保守的miR-21的結(jié)合位點(diǎn)。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),心肌細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)水平隨著過氧化氫處理濃度的增加而表達(dá)上調(diào)。并且在過表達(dá)miR-21后,PDCD4的表達(dá)受到顯著抑制,而抑制miR-21后PDCD4表達(dá)上調(diào)；熒光素酶報(bào)告基因發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染了野生型的PDCD4載體同時(shí)又過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)miR-21的細(xì)胞中,熒光素酶的活性顯著降低,證實(shí)miR-21與PDCD4是通過直接的結(jié)合而發(fā)揮抑制作用。4.在氧化應(yīng)激處理之前給予exosomes進(jìn)行預(yù)保護(hù)后,exosomes可以明顯提高細(xì)胞中miR-21的水平,且細(xì)胞中cleaved caspase-3和PDCD4的蛋白水平明顯降低。Annexin V/PI雙染流式分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與H2O2-ctrl組33.29%的凋亡率相比較,H2O2-exo預(yù)保護(hù)細(xì)胞的凋亡率降低至13.58%,而Nor-exo的預(yù)保護(hù)也有一定作用,但凋亡率只降低至17.39%,不如H2O2-exo預(yù)保護(hù)作用明顯。結(jié)論：1.成年小鼠CPCs含量有限,用免疫磁珠特異性結(jié)合的方式可以分離出純度較高、且較為特異的Sca-1+的心臟干細(xì)胞,CPCs同大多數(shù)細(xì)胞類型一樣,可以分泌出exosomes,且分泌exosomes的濃度與內(nèi)容物會根據(jù)細(xì)胞所處微環(huán)境的變化而改變；并且exosomes可以被H9C2細(xì)胞所攝取；2.氧化應(yīng)激刺激下的CPCs分泌較多exosomes,并且其中的miR-21出現(xiàn)顯著差異；氧化應(yīng)激可以引起心肌細(xì)胞凋亡,且發(fā)生凋亡時(shí)miR-21顯著降低,說明miR-21與氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心肌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)；3. PDCD4作為miR-21的靶基因,參與到miR-21調(diào)控的凋亡過程之中,正常細(xì)胞受到miR-21對PDCD4的抑制調(diào)控,一旦發(fā)生氧化應(yīng)激的刺激,細(xì)胞miR-21下降導(dǎo)致PDCD4抑制被解除,進(jìn)而使細(xì)胞容易發(fā)生凋亡；4.氧化應(yīng)激刺激CPCs后分泌的Exosomes的預(yù)保護(hù)可明顯緩解心肌細(xì)胞由于氧化應(yīng)激所致的凋亡,與這種exosomes中包含大量的miR-21密切相關(guān),大量的miR-21傳遞到心肌細(xì)胞后重建了心肌細(xì)胞內(nèi)的miR-21/PDCD4負(fù)調(diào)節(jié),降低細(xì)胞中PDCD4的表達(dá),進(jìn)而緩解心肌細(xì)胞凋亡。因此,本研究主要闡明了心臟干細(xì)胞分泌的exosomes在缺血性心肌損傷的疾病模型中對于心肌細(xì)胞的保護(hù)性作用,首次提出干細(xì)胞心肌修復(fù)作用的系統(tǒng)性機(jī)制是通過exosomes傳遞miR-21到心肌細(xì)胞中調(diào)控PDCD4來完成的,為闡明干細(xì)胞治療心肌梗死的作用機(jī)制提供了新的視野,并有可能開辟一個(gè)潛在的非細(xì)胞治療策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 蔡明清;心肌細(xì)胞再生和腔室重塑[J];中國分子心臟病學(xué)雜志;2002年01期

2 李娜;;心肌細(xì)胞可以再生[J];科技導(dǎo)報(bào);2009年08期

3 薛惠文;章靜波;;人類心肌細(xì)胞的更新[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2009年07期

4 崔曉兵;;人類成年心肌細(xì)胞可以更新[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2010年06期

5 蘇倩文;;心肌細(xì)胞可以再生[J];心血管病防治知識(科普版);2013年05期

6 周亮 ,曾曉榮,楊艷,劉智飛,李妙齡,裴杰;豚鼠心肌細(xì)胞急性酶分離方法[J];四川生理科學(xué)雜志;2000年02期

7 萬朝敏,俞紅吉,吳泰相,高云欽,周密,鄧建軍,王正榮;免疫損傷對離體培養(yǎng)心肌細(xì)胞力學(xué)特性的影響[J];中國醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志;2000年02期

8 賈士東,修瑞娟;心肌細(xì)胞功能的研究[J];中國微循環(huán);2000年03期

9 何作云,劉健;心肌細(xì)胞核鈣信號的研究[J];重慶醫(yī)學(xué);2002年02期

10 張家平;絲裂素活化蛋白激酶與心肌細(xì)胞效應(yīng)[J];重慶醫(yī)學(xué);2002年11期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張保國;趙萍;張文杰;;鉬對培養(yǎng)心肌細(xì)胞存活的影響[A];中國營養(yǎng)學(xué)會首屆微量元素專題討論會論文摘要匯編[C];1985年

2 房亞東;黃躍生;黨永明;張家平;張東霞;宋華培;張瓊;;上調(diào)微管相關(guān)蛋白4對缺氧早期心肌細(xì)胞活力影響的實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會燒傷外科學(xué)分會2009年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

3 唐陶;王世騏;莊茁;;基底應(yīng)變對心肌細(xì)胞的影響[A];北京力學(xué)會第14屆學(xué)術(shù)年會論文集[C];2008年

4 何作云;劉健;王培勇;;心肌細(xì)胞核鈣信號的研究[A];21世紀(jì)醫(yī)學(xué)工程學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2001年

5 何作云;劉健;;心肌細(xì)胞核鈣信號的研究[A];第九次全國生物物理大會學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2002年

6 滕苗;黃躍生;黨永明;房亞東;張瓊;;微管干預(yù)劑對缺氧心肌細(xì)胞糖酵解途徑關(guān)鍵酶的影響[A];第六屆全國燒傷救治專題研討會論文匯編[C];2009年

7 宋新愛;林元喜;樊小力;;心肌細(xì)胞的純化[A];中國病理生理學(xué)會第九屆全國代表大會及學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2010年

8 劉興茂;陳昭烈;劉紅;熊福銀;;心肌細(xì)胞體外三維培養(yǎng)的初步研究[A];中國生物工程學(xué)會第三次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2001年

9 熊江輝;李瑩輝;聶捷琳;張曉鈾;丁柏;;槲皮素對回轉(zhuǎn)條件下心肌細(xì)胞—氧化氮合成的影響[A];中國宇航學(xué)會航天醫(yī)學(xué)工程專業(yè)委員會、中國空間科學(xué)學(xué)會空間生命專業(yè)委員會聯(lián)合學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2001年

10 陽冬梅;吳才宏;程和平;;鈣調(diào)蛋白對心肌細(xì)胞興奮—收縮耦聯(lián)的調(diào)節(jié)作用[A];第九次全國生物物理大會學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2002年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 劉黎;荷蘭培育心肌細(xì)胞取得進(jìn)展[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2008年

2 編譯 曉魚;人類心肌細(xì)胞可再生[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2009年

3 孫國根;心肌細(xì)胞的形成和再生有望被誘導(dǎo)[N];中國醫(yī)藥報(bào);2012年

4 吳偉農(nóng);心肌細(xì)胞能自我修復(fù)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2001年

5 陳丹;移植的人體細(xì)胞可與豚鼠受體心肌同步跳動[N];科技日報(bào);2012年

6 記者胡德榮;心肌細(xì)胞能體外培養(yǎng)[N];健康報(bào);2002年

7 楊洋;骨髓細(xì)胞生成心肌細(xì)胞[N];衛(wèi)生與生活報(bào);2003年

8 吳理茂 李連達(dá);中藥在心肌細(xì)胞移植中的作用[N];中國醫(yī)藥報(bào);2003年

9 ;急性心梗治療獲重要突破 心肌細(xì)胞可以再生[N];中國保險(xiǎn)報(bào);2003年

10 記者 張曄;基因調(diào)控讓壞死的心肌細(xì)胞“復(fù)活”[N];科技日報(bào);2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 吳東棟;硫化氫提高Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性的作用及其機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

2 徐磊;MMI-0100通過對心肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中MK2的抑制作用降低心肌纖維化程度的研究[D];山東大學(xué);2015年

3 牟永潮;基于納米材料再造心肌組織生物學(xué)評價(jià)與心梗治療研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2015年

4 李娜;PDE5抑制劑Sildenafi1對心梗后心衰線粒體能量代謝保護(hù)及機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

5 陳亮;miR-199a對大鼠心肌細(xì)胞自噬的調(diào)控研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 王曉麗;附子人參配伍對大鼠心肌細(xì)胞保護(hù)作用的研究[D];長春中醫(yī)藥大學(xué);2015年

7 肖劍鋒;碘化-N-正丁基氟哌啶醇對缺氧心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的保護(hù)作用[D];汕頭大學(xué);2011年

8 張翠翠;MG53調(diào)節(jié)心臟輔助亞基KChIP2表達(dá)的分子機(jī)制及在心電穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中的作用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

9 張海彬;miR-711在心肌缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制[D];吉林大學(xué);2016年

10 位庚;心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷對心肌細(xì)胞的影響及通絡(luò)干預(yù)研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 付麗;硫化氫后處理對大鼠缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2015年

2 黃玉潔;miR-218調(diào)控小鼠胚胎干細(xì)胞體外定向分化心肌細(xì)胞研究[D];浙江大學(xué);2015年

3 李品雅;華蟾毒精對心肌細(xì)胞L型鈣電流，鈣瞬變和收縮力的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 劉洋;野薔薇苷對H_2O_2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 朱燕梅;銀杏葉提取物保護(hù)心肌細(xì)胞抗氧化損傷及其基于Keap1/Nrf2/ARE通路的作用機(jī)制[D];成都醫(yī)學(xué)院;2015年

6 劉莉;心肌細(xì)胞TLR4促進(jìn)心梗后心臟炎癥反應(yīng)的研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

7 盧杏;體外轉(zhuǎn)染CyclinA2基因?qū)υ笫笮募〖?xì)胞增殖的影響[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年

8 竇夢怡;缺氧時(shí)心肌細(xì)胞自噬的變化及其機(jī)理的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

9 蘭曉東;微管解聚對心肌細(xì)胞電生理特性的影響及微管定量分析方法研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

10 李熠;TGR5在高糖誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制[D];四川醫(yī)科大學(xué);2015年

，

本文編號：2400326