【摘要】：心血管系統(tǒng)疾病是威脅人類生命的主要疾病之一。心肌缺血性疾病如動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷以及心力衰竭等都有一個相同的病理改變,即在病變的區(qū)域產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS),活性氧的累積會造成心肌細胞的凋亡和壞死,進而加速心臟疾病的病理進程。因此,研究者們正在急切地尋求一個有效的治療手段來緩解氧化應(yīng)激對心血管系統(tǒng)的損傷。干細胞移植在缺血性心肌病的治療中具有廣泛的應(yīng)用前景,不同來源的干細胞的移植都被證實可以在不同程度上提高心功能,其中包括成體自體心臟固有的干細胞——心臟干(祖)細胞(Cardiac progenitor cells, CPCs),由于其來源于自體的組織,可以很好地避免異體移植排斥效應(yīng),因此越來越受眾多研究者關(guān)注。但是,心臟干細胞對于心肌保護的作用的機制目前還有待進一步闡明,通常移植后干細胞的常規(guī)生理過程包括：干細胞注射到病變區(qū)域、著床、分化,然后替代損傷的心肌組織。盡管干細胞直接的分化作用和間接的旁分泌效應(yīng)都已經(jīng)被證實是干細胞心肌修復(fù)作用的潛在機制,但是近幾年來越來越多的證據(jù)顯示移植后的干細胞效應(yīng)主要來自于干細胞的旁分泌作用,干細胞可以分泌出多種旁分泌因子,這些因子在減少原有的心肌損傷和促進受損區(qū)域細胞的修復(fù)能力等方面都具有重要作用。過去的幾年中,許多研究者證實CPCs分泌的一種名叫外泌體(exosomes)的雙層膜的納米級細胞外囊泡可以顯著改善受損心臟的心功能。Exosomes是一種直徑在30-100nm的膜性囊泡,是囊泡轉(zhuǎn)運家族的重要組成部分,可以將里面包裹的眾多轉(zhuǎn)錄因子、小非編碼RNA (microRNA, miRNAs)、長鏈非編碼(long non-coding RNA) RNA (lncRNA)等成分通過與目的細胞融合的方式傳遞到靶細胞中,進而調(diào)控細胞中一些重要的信號通路。CPCs通過分泌exosomes,攜帶一些CPC中可以改善心肌損傷重要因子,傳遞到心肌細胞內(nèi),從而發(fā)揮心肌保護作用。但是exosomes的內(nèi)容物會根據(jù)病理條件的不同而發(fā)生改變,不同的因子就會導(dǎo)致靶細胞會有不同的命運。因此,對于處在特定病理條件下的exosomes內(nèi)容物的探究非常必要且有意義,特別是在氧化應(yīng)激損傷的情況下,CPCs到底分泌的帶有何種因子的exosomes可以保護心肌細胞,進而改善心功能?在exosomes所有的內(nèi)容物中,miRNAs被證實在心梗等心肌缺血性疾病中控制著某些重要的病理生理轉(zhuǎn)歸,這種單鏈的、由大約22個核苷酸組成的非編碼RNAs參與到眾多基因轉(zhuǎn)錄后翻譯的調(diào)控中。MiRNAs可以抑制或者促進心肌細胞的凋亡,也可以調(diào)控活性氧導(dǎo)致的心臟疾病。但是CPCs分泌的exosomes在氧化應(yīng)激的病理微環(huán)境下是否都可以保護心肌細胞?而exosomes中的miRNAs在這個過程中又發(fā)揮了怎樣的角色?因此,本研究主要探究CPCs分泌的外泌體中對于活性氧累積導(dǎo)致的心肌損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用的miRNAs以及其調(diào)控機制。研究方法：1.采用干細胞表面抗原(stem cell antigen-1, Sca-1)標記免疫磁珠,分選帶有這種特定表型的成年小鼠的心臟干細胞,用免疫熒光鑒定其表型,流式細胞術(shù)分析分選前后Sca-1陽性的細胞比例；收集CPCs培養(yǎng)48h后的培養(yǎng)上清,用ExoQuick外泌體提取液對CPCs分泌的exosomes進行提取,用納米粒子示蹤儀(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)對exosomes進行粒徑分布以及濃度的分析,透射電鏡進一步觀察exosomes的超微結(jié)構(gòu),最后用Western blot對其表面標記(CD9、CD63、Alix)進行定性鑒定；免疫熒光檢測H9C2細胞對膜染料PHK-26標記后的exosomes的攝取情況；2.用過氧化氫模擬心肌受損時氧化應(yīng)激的環(huán)境,確定過氧化氫的濃度,處理CPC,NTA分析用該濃度過氧化氫處理前后分泌exosomes量的差異；選擇13個與本研究相關(guān)的miRNAs, RT-qPCR解析在exosomes里面可能包含的miRNAs,并比較氧化應(yīng)激刺激前后exosomes內(nèi)的miRNAs的差異(miR-X)；3.用RT-qPCR檢測miR-X在氧化應(yīng)激損傷的心肌細胞中表達差異,TargetScan預(yù)測差異miR-X的靶基因,轉(zhuǎn)染miR-X模擬物和抑制物Western Blot檢測靶蛋白的變化,驗證miR-X與靶蛋白相互調(diào)節(jié)在心肌細胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致?lián)p傷的作用,采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸iR-X與靶蛋白的直接結(jié)合效應(yīng)進行驗證;4.分別用CPC共培養(yǎng)、正常exosomes和過氧化氫刺激后的exosomes預(yù)處理心肌細胞,再對心肌細胞進行氧化應(yīng)激損傷處理,RT-qPCR檢測miR-X的改變,WB檢測細胞中miR-X的靶蛋白和凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達水平,流式細胞儀檢測Annexin V/PI雙染后處于各時期細胞的比例,反映細胞的凋亡水平。結(jié)果：1.原代培養(yǎng)的CPCs形態(tài)呈不規(guī)則的梭形,流式細胞儀對分選前后的細胞進行表面標記物Sca-1陽性比例的分析,結(jié)果顯示,分選后Sca-1+細胞的比例較分選前顯著增加(95.04±4.29% vs.1.31±0.42%),免疫熒光結(jié)果提示,分選后CPC幾乎全部表達分選標記Sca-1蛋白；CPCs培養(yǎng)上清離心之后有明顯白色沉淀沉積于管底,NTA結(jié)果檢測出exosomes的粒徑分布范圍以及濃度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分粒子都處于exosomes直徑的范圍(30-100nm),含量最多的粒子直徑約為83nm,濃度為9.16×109個/m1.投射電鏡檢測到雙層膜的直徑在100nm左右的囊性小泡,進一步用Western Blot分析該白色沉淀發(fā)現(xiàn),我們所提取出的物質(zhì)陽性表達CD63、CD9、Alix蛋白；exosomes被PKH26標記后,與H9C2細胞中共孵育12h后,免疫熒光可見大量紅色物質(zhì)在胞漿聚集；2.隨著過氧化氫處理濃度增加,細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化光,鏡下可見細胞皺縮漂浮甚至死亡,用Western Blot發(fā)現(xiàn)cleaved caspase-3表達明顯增加,100μM效果明顯,且細胞無致死性損傷,因此本研究采用100μMH2O2作為氧化應(yīng)激損傷濃度。Exosomes的NTA計數(shù)結(jié)果顯示,與正常CPC (Nor-CPC)相比((1.31±0.29)×109),100μM H202可以促使CPCs (H2O2-CPC)分泌較多的exosomes((3.36±0.66)×109); qPCR結(jié)果顯示,可以在Nor-CPC的exosomes (Nor-exo)和H2O2-CPC的exosomes (H2O2-exo)成功擴增出6個相關(guān)的miRNAs(miR-21,24,214,132,195,210),且miR-21在Nor-exo和H2O2-exo表達水平具有顯著性差異；對轉(zhuǎn)染miR-21的模擬物和抑制物后,Western blot結(jié)果顯示,過表達miR-21后激活型caspase-3的表達顯著下調(diào),而抑制miR-21.的表達可顯著上調(diào)激活型caspase-3,提示miR-21在H9C2細胞中是重要的抗過氧化氫誘導(dǎo)的凋亡因子。3. Target Scan預(yù)測出,在不同種屬來源的PDCD4 mRNA的3'UTR的不同區(qū)域,都有一段相對保守的miR-21的結(jié)合位點。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),心肌細胞中PDCD4的表達水平隨著過氧化氫處理濃度的增加而表達上調(diào)。并且在過表達miR-21后,PDCD4的表達受到顯著抑制,而抑制miR-21后PDCD4表達上調(diào)；熒光素酶報告基因發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染了野生型的PDCD4載體同時又過表達細胞內(nèi)miR-21的細胞中,熒光素酶的活性顯著降低,證實miR-21與PDCD4是通過直接的結(jié)合而發(fā)揮抑制作用。4.在氧化應(yīng)激處理之前給予exosomes進行預(yù)保護后,exosomes可以明顯提高細胞中miR-21的水平,且細胞中cleaved caspase-3和PDCD4的蛋白水平明顯降低。Annexin V/PI雙染流式分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與H2O2-ctrl組33.29%的凋亡率相比較,H2O2-exo預(yù)保護細胞的凋亡率降低至13.58%,而Nor-exo的預(yù)保護也有一定作用,但凋亡率只降低至17.39%,不如H2O2-exo預(yù)保護作用明顯。結(jié)論：1.成年小鼠CPCs含量有限,用免疫磁珠特異性結(jié)合的方式可以分離出純度較高、且較為特異的Sca-1+的心臟干細胞,CPCs同大多數(shù)細胞類型一樣,可以分泌出exosomes,且分泌exosomes的濃度與內(nèi)容物會根據(jù)細胞所處微環(huán)境的變化而改變；并且exosomes可以被H9C2細胞所攝��；2.氧化應(yīng)激刺激下的CPCs分泌較多exosomes,并且其中的miR-21出現(xiàn)顯著差異；氧化應(yīng)激可以引起心肌細胞凋亡,且發(fā)生凋亡時miR-21顯著降低,說明miR-21與氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心肌細胞的凋亡密切相關(guān)；3. PDCD4作為miR-21的靶基因,參與到miR-21調(diào)控的凋亡過程之中,正常細胞受到miR-21對PDCD4的抑制調(diào)控,一旦發(fā)生氧化應(yīng)激的刺激,細胞miR-21下降導(dǎo)致PDCD4抑制被解除,進而使細胞容易發(fā)生凋亡；4.氧化應(yīng)激刺激CPCs后分泌的Exosomes的預(yù)保護可明顯緩解心肌細胞由于氧化應(yīng)激所致的凋亡,與這種exosomes中包含大量的miR-21密切相關(guān),大量的miR-21傳遞到心肌細胞后重建了心肌細胞內(nèi)的miR-21/PDCD4負調(diào)節(jié),降低細胞中PDCD4的表達,進而緩解心肌細胞凋亡。因此,本研究主要闡明了心臟干細胞分泌的exosomes在缺血性心肌損傷的疾病模型中對于心肌細胞的保護性作用,首次提出干細胞心肌修復(fù)作用的系統(tǒng)性機制是通過exosomes傳遞miR-21到心肌細胞中調(diào)控PDCD4來完成的,為闡明干細胞治療心肌梗死的作用機制提供了新的視野,并有可能開辟一個潛在的非細胞治療策略。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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本文編號：2400326