【摘要】：心肌缺血-再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury,I/R injury)是由于動(dòng)脈粥樣硬化、血栓或冠狀動(dòng)脈痙攣所致的急性心肌供血不足后,在一定時(shí)間條件下進(jìn)行再灌注治療過程中產(chǎn)生了大量活性氧產(chǎn)物(Reactive Oxygen Species,ROS),導(dǎo)致不同程度的心肌損害。缺血-再灌注損傷是一種復(fù)雜的病理生理過程,受多種因素所調(diào)控。正常情況下,低濃度的ROS可以調(diào)節(jié)血管細(xì)胞的功能,但過度氧化應(yīng)激導(dǎo)致活性氧簇的蓄積,當(dāng)這種蓄積超過了機(jī)體抗氧化防御的能力,就會(huì)造成組織細(xì)胞損傷,引起基因突變、細(xì)胞死亡、蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞等,從而引起了一系列的生理生化紊亂。在心肌缺血再灌注損傷中,氧化應(yīng)激損傷會(huì)導(dǎo)致各種類型的細(xì)胞損傷包括壞死、凋亡和自噬。其中細(xì)胞凋亡一直以來都是生物學(xué)研究熱點(diǎn),而細(xì)胞自噬在氧化應(yīng)激損傷中的作用也逐漸被人們所重視。自噬通過清除細(xì)胞內(nèi)受損、衰老的大分子蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器發(fā)揮其生理作用。而氧化應(yīng)激及過多的活性氧產(chǎn)物(ROS)是自噬的重要刺激因素。Micro RNA(miRNA)是一類只有20-25個(gè)核苷酸長度的微小的非編碼的RNA序列,近20年關(guān)于miRNA的相關(guān)研究層出不窮,是目前生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)話題。MiRNA的生物學(xué)效應(yīng)非常廣泛,它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)的各個(gè)方面,包括細(xì)胞分化、增殖、血管發(fā)生及凋亡等。心臟及血管的生理及病理生理也受其調(diào)節(jié),其中,miRNA-210被認(rèn)為是體內(nèi)最主要的缺氧相關(guān)性miRNA,無論在正常細(xì)胞中或腫瘤細(xì)胞的缺氧反應(yīng)過程中,mi R-210的上調(diào)都作為一個(gè)持續(xù)性特征而存在,并從多個(gè)方面調(diào)節(jié)心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展。近期的研究發(fā)現(xiàn)miRNA-210不僅僅通過多種途徑參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控,還可能參與調(diào)控細(xì)胞自噬過程。而在缺氧過程中也多伴隨著不同程度的氧化應(yīng)激損傷。由此本實(shí)驗(yàn)提出如下假設(shè):miRNA-210可能參與了細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程中細(xì)胞凋亡和自噬的發(fā)生及發(fā)展。MiR-210通過抑制特定靶基因m RNAs的蛋白質(zhì)翻譯,或促進(jìn)相應(yīng)靶基因的m RNAs的降解,來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。到目前為止,多個(gè)研究已經(jīng)深入探討了MiR-210及其靶基因之間的作用關(guān)系,常見的靶基因包括e2f3,MNT,Casp8ap2,ephrin-A3,ISCU,COX10,GPD1L and BNIP3,在這些靶基因中,BNIP3(BCL-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3)是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白的一員,并且有多個(gè)研究表明BNIP3在細(xì)胞的壞死、凋亡乃至自噬過程中發(fā)揮重要作用。BNIP3是僅含有BH3結(jié)構(gòu)域的非典型的Bcl-2同源物,定位于線粒體外膜上,參與細(xì)胞的死亡、自噬和程序性線粒體清除。BNIP3可以通過調(diào)控線粒體活性氧產(chǎn)物的產(chǎn)生從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,或通過解除Beclin-1與抗凋亡蛋白Bcl-2家族的結(jié)合來釋放Beclin-1,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。有實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明BNIP3通過抑制m TOR發(fā)揮其促細(xì)胞自噬的作用,而miRNA-210則被證明能夠通過抑制BNIP3從而發(fā)揮抗凋亡作用的。本實(shí)驗(yàn)利用H_9C_2細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型,以此為研究對象,檢測了心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下miRNA-210的表達(dá)變化,探討了miRNA-210在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡過程中對凋亡和自噬的影響以及作用機(jī)制,同時(shí)闡明了BNIP3蛋白在這個(gè)過程中所扮演的角色,為心血管疾病的治療提供新的線索。方法1.利用過氧化氫刺激H_9C_2細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞模型,分別用MTT法、LDH檢測、Caspase-3活性檢測、TUNE染色、DCFH-DA活性氧檢測、線粒體膜電位檢、超氧化物歧化酶和丙二醛檢測、Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá),以及共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞LC3點(diǎn)狀聚集來反應(yīng)氧化應(yīng)激的損傷程度。應(yīng)用3-MA來抑制自噬,從而觀察自噬在心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用。2.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測過氧化氫刺激后細(xì)胞mi R-210的表達(dá)。構(gòu)建mi R-210高表達(dá)和低表達(dá)模型,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA-210 mimics及inhibitor質(zhì)粒,檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo),Western blot檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá),觀察自噬在不同mi R-210表達(dá)情況下的作用。3.Western blot檢測過氧化氫刺激后細(xì)胞BNIP3蛋白表達(dá)的變化。通過熒光素酶報(bào)告基因(luciferase assay)檢測mi R-210與BNIP3的關(guān)系。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA-210 mimics質(zhì)粒及inhibitor質(zhì)粒,應(yīng)用Western blot檢測轉(zhuǎn)染后BNIP3蛋白的表達(dá)變化。4.構(gòu)建BNIP3基因敲除模型,采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法,將BNIP3的si RNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H_9C_2細(xì)胞,并進(jìn)行過氧化氫處理,利用Western blot方法檢測LC3蛋白的表達(dá)水平,共聚焦顯微鏡觀察LC3點(diǎn)狀聚集。5.構(gòu)建BNIP3過表達(dá)細(xì)胞模型,將過表達(dá)載體質(zhì)粒與mi R-210 mimic共同轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi),Western blot檢測BNIP3及LC3的蛋白表達(dá),利用共聚焦顯微鏡觀察LC3點(diǎn)狀聚集。結(jié)果1.過氧化氫可明顯抑制心肌細(xì)胞存活率,氧化損傷指標(biāo)明顯增加,線粒體膜電勢降低,細(xì)胞凋亡水平增高;自噬相關(guān)蛋白LC3II表達(dá)增加,免疫熒光實(shí)驗(yàn)激光共聚焦觀察心肌細(xì)胞內(nèi)自噬點(diǎn)明顯增多,抑制細(xì)胞自噬后細(xì)胞存活率明顯增多,氧化損傷明顯降低。2.過氧化氫能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程中mi R-210的表達(dá)水平上調(diào);過表達(dá)mi R-210能夠減輕過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷及細(xì)胞自噬活化水平;下調(diào)mi R-210的表達(dá)則加重心肌細(xì)胞損傷,但在下調(diào)mi R-210過程中抑制自噬能夠部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞損傷程度,由此推測,mi R-210在心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程中起到了一定的細(xì)胞保護(hù)作用,并且這種保護(hù)作用可能是部分通過抑制自噬來實(shí)現(xiàn)的。3.心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程中BNIP3的蛋白表達(dá)明顯上調(diào),并且該種上調(diào)呈時(shí)間依賴性;熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明BNIP3是mi R-210的下游靶基因;高表達(dá)mi R-210可以抑制BNIP3蛋白表達(dá);利用si RNA抑制BNIP3蛋白表達(dá)后,過氧化氫處理后的心肌細(xì)胞自噬水平有所下降,這些結(jié)果提示了BNIP3參與了過氧化氫誘導(dǎo)的H_9C_2細(xì)胞的自噬活化過程。4.實(shí)驗(yàn)的最后同時(shí)上調(diào)mi R-210以及BNIP3的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)上調(diào)BNIP3的表達(dá)后部分抵消了上調(diào)mi R-210所帶來的抑制自噬活化的作用,提示我們在過氧化氫誘導(dǎo)的H_9C_2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程中mi R-210是通過抑制BNIP3的表達(dá)來部分發(fā)揮抑制自噬活化的作用的。結(jié)論1.過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷一方面能夠觸發(fā)細(xì)胞線粒體途徑凋亡,并激活caspase級聯(lián)反應(yīng),另一方面可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬活化,抑制自噬后細(xì)胞凋亡減少,這也表明活化的自噬對于心肌細(xì)胞具有一定的損傷作用,氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞可能是通過凋亡和自噬兩種途徑介導(dǎo)。2.在心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程中mi R-210的表達(dá)水平明顯上調(diào),mi R-210作為上游調(diào)控因子,參與了氧化應(yīng)激過程,高表達(dá)mi R-210減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,同時(shí)減少了細(xì)胞凋亡的發(fā)生和細(xì)胞自噬的活化,表明mi R-210作為一個(gè)抗氧化因子可通過抑制凋亡和自噬從而對心肌細(xì)胞起到了一定的保護(hù)作用。3.心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程中細(xì)胞自噬的活化可能是通過BNIP3蛋白介導(dǎo)的,mi R-210可以靶向作用于BNIP3,進(jìn)而抑制細(xì)胞自噬活化。創(chuàng)新點(diǎn)及研究意義本研究首次證實(shí)了mi R-210可抑制氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞自噬水平活化,闡明了mi R-210作為上游因子通過直接抑制其靶基因BNIP3的蛋白表達(dá)來發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。本研究為心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù),為mi R-210在心血管疾病中的保護(hù)作用提供理論基礎(chǔ),為進(jìn)一步臨床中診斷和治療提供新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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本文編號：2375853