【摘要】：心肌缺血-再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury,I/R injury)是由于動脈粥樣硬化、血栓或冠狀動脈痙攣所致的急性心肌供血不足后,在一定時間條件下進行再灌注治療過程中產(chǎn)生了大量活性氧產(chǎn)物(Reactive Oxygen Species,ROS),導致不同程度的心肌損害。缺血-再灌注損傷是一種復雜的病理生理過程,受多種因素所調(diào)控。正常情況下,低濃度的ROS可以調(diào)節(jié)血管細胞的功能,但過度氧化應激導致活性氧簇的蓄積,當這種蓄積超過了機體抗氧化防御的能力,就會造成組織細胞損傷,引起基因突變、細胞死亡、蛋白質變性、脂質過氧化、細胞膜結構破壞等,從而引起了一系列的生理生化紊亂。在心肌缺血再灌注損傷中,氧化應激損傷會導致各種類型的細胞損傷包括壞死、凋亡和自噬。其中細胞凋亡一直以來都是生物學研究熱點,而細胞自噬在氧化應激損傷中的作用也逐漸被人們所重視。自噬通過清除細胞內(nèi)受損、衰老的大分子蛋白質以及細胞器發(fā)揮其生理作用。而氧化應激及過多的活性氧產(chǎn)物(ROS)是自噬的重要刺激因素。Micro RNA(miRNA)是一類只有20-25個核苷酸長度的微小的非編碼的RNA序列,近20年關于miRNA的相關研究層出不窮,是目前生物學研究領域的熱點話題。MiRNA的生物學效應非常廣泛,它能夠調(diào)節(jié)細胞生物學的各個方面,包括細胞分化、增殖、血管發(fā)生及凋亡等。心臟及血管的生理及病理生理也受其調(diào)節(jié),其中,miRNA-210被認為是體內(nèi)最主要的缺氧相關性miRNA,無論在正常細胞中或腫瘤細胞的缺氧反應過程中,mi R-210的上調(diào)都作為一個持續(xù)性特征而存在,并從多個方面調(diào)節(jié)心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展。近期的研究發(fā)現(xiàn)miRNA-210不僅僅通過多種途徑參與細胞凋亡的調(diào)控,還可能參與調(diào)控細胞自噬過程。而在缺氧過程中也多伴隨著不同程度的氧化應激損傷。由此本實驗提出如下假設:miRNA-210可能參與了細胞氧化應激損傷過程中細胞凋亡和自噬的發(fā)生及發(fā)展。MiR-210通過抑制特定靶基因m RNAs的蛋白質翻譯,或促進相應靶基因的m RNAs的降解,來調(diào)節(jié)靶基因的表達。到目前為止,多個研究已經(jīng)深入探討了MiR-210及其靶基因之間的作用關系,常見的靶基因包括e2f3,MNT,Casp8ap2,ephrin-A3,ISCU,COX10,GPD1L and BNIP3,在這些靶基因中,BNIP3(BCL-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3)是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白的一員,并且有多個研究表明BNIP3在細胞的壞死、凋亡乃至自噬過程中發(fā)揮重要作用。BNIP3是僅含有BH3結構域的非典型的Bcl-2同源物,定位于線粒體外膜上,參與細胞的死亡、自噬和程序性線粒體清除。BNIP3可以通過調(diào)控線粒體活性氧產(chǎn)物的產(chǎn)生從而誘導細胞自噬,或通過解除Beclin-1與抗凋亡蛋白Bcl-2家族的結合來釋放Beclin-1,進而誘導細胞自噬。有實驗已經(jīng)證明BNIP3通過抑制m TOR發(fā)揮其促細胞自噬的作用,而miRNA-210則被證明能夠通過抑制BNIP3從而發(fā)揮抗凋亡作用的。本實驗利用H_9C_2細胞建立氧化應激模型,以此為研究對象,檢測了心肌細胞氧化應激狀態(tài)下miRNA-210的表達變化,探討了miRNA-210在氧化應激誘導心肌細胞死亡過程中對凋亡和自噬的影響以及作用機制,同時闡明了BNIP3蛋白在這個過程中所扮演的角色,為心血管疾病的治療提供新的線索。方法1.利用過氧化氫刺激H_9C_2細胞構建氧化應激損傷的細胞模型,分別用MTT法、LDH檢測、Caspase-3活性檢測、TUNE染色、DCFH-DA活性氧檢測、線粒體膜電位檢、超氧化物歧化酶和丙二醛檢測、Western blot檢測自噬相關蛋白LC3的表達,以及共聚焦顯微鏡觀察細胞LC3點狀聚集來反應氧化應激的損傷程度。應用3-MA來抑制自噬,從而觀察自噬在心肌細胞氧化應激損傷中的作用。2.利用實時熒光定量PCR檢測過氧化氫刺激后細胞mi R-210的表達。構建mi R-210高表達和低表達模型,瞬時轉染miRNA-210 mimics及inhibitor質粒,檢測細胞凋亡相關指標,Western blot檢測細胞自噬相關蛋白LC3的表達,觀察自噬在不同mi R-210表達情況下的作用。3.Western blot檢測過氧化氫刺激后細胞BNIP3蛋白表達的變化。通過熒光素酶報告基因(luciferase assay)檢測mi R-210與BNIP3的關系。瞬時轉染miRNA-210 mimics質粒及inhibitor質粒,應用Western blot檢測轉染后BNIP3蛋白的表達變化。4.構建BNIP3基因敲除模型,采用瞬時轉染的方法,將BNIP3的si RNA質粒轉染至H_9C_2細胞,并進行過氧化氫處理,利用Western blot方法檢測LC3蛋白的表達水平,共聚焦顯微鏡觀察LC3點狀聚集。5.構建BNIP3過表達細胞模型,將過表達載體質粒與mi R-210 mimic共同轉染至細胞內(nèi),Western blot檢測BNIP3及LC3的蛋白表達,利用共聚焦顯微鏡觀察LC3點狀聚集。結果1.過氧化氫可明顯抑制心肌細胞存活率,氧化損傷指標明顯增加,線粒體膜電勢降低,細胞凋亡水平增高;自噬相關蛋白LC3II表達增加,免疫熒光實驗激光共聚焦觀察心肌細胞內(nèi)自噬點明顯增多,抑制細胞自噬后細胞存活率明顯增多,氧化損傷明顯降低。2.過氧化氫能夠誘導心肌細胞氧化應激損傷過程中mi R-210的表達水平上調(diào);過表達mi R-210能夠減輕過氧化氫誘導的心肌細胞氧化損傷及細胞自噬活化水平;下調(diào)mi R-210的表達則加重心肌細胞損傷,但在下調(diào)mi R-210過程中抑制自噬能夠部分逆轉細胞損傷程度,由此推測,mi R-210在心肌細胞氧化應激損傷過程中起到了一定的細胞保護作用,并且這種保護作用可能是部分通過抑制自噬來實現(xiàn)的。3.心肌細胞氧化應激損傷過程中BNIP3的蛋白表達明顯上調(diào),并且該種上調(diào)呈時間依賴性;熒光素酶報告基因實驗結果表明BNIP3是mi R-210的下游靶基因;高表達mi R-210可以抑制BNIP3蛋白表達;利用si RNA抑制BNIP3蛋白表達后,過氧化氫處理后的心肌細胞自噬水平有所下降,這些結果提示了BNIP3參與了過氧化氫誘導的H_9C_2細胞的自噬活化過程。4.實驗的最后同時上調(diào)mi R-210以及BNIP3的表達水平,發(fā)現(xiàn)上調(diào)BNIP3的表達后部分抵消了上調(diào)mi R-210所帶來的抑制自噬活化的作用,提示我們在過氧化氫誘導的H_9C_2細胞氧化應激損傷過程中mi R-210是通過抑制BNIP3的表達來部分發(fā)揮抑制自噬活化的作用的。結論1.過氧化氫誘導心肌細胞氧化應激損傷一方面能夠觸發(fā)細胞線粒體途徑凋亡,并激活caspase級聯(lián)反應,另一方面可以誘導細胞自噬活化,抑制自噬后細胞凋亡減少,這也表明活化的自噬對于心肌細胞具有一定的損傷作用,氧化應激損傷心肌細胞可能是通過凋亡和自噬兩種途徑介導。2.在心肌細胞氧化應激損傷過程中mi R-210的表達水平明顯上調(diào),mi R-210作為上游調(diào)控因子,參與了氧化應激過程,高表達mi R-210減輕氧化應激誘導的細胞損傷,同時減少了細胞凋亡的發(fā)生和細胞自噬的活化,表明mi R-210作為一個抗氧化因子可通過抑制凋亡和自噬從而對心肌細胞起到了一定的保護作用。3.心肌細胞氧化應激損傷過程中細胞自噬的活化可能是通過BNIP3蛋白介導的,mi R-210可以靶向作用于BNIP3,進而抑制細胞自噬活化。創(chuàng)新點及研究意義本研究首次證實了mi R-210可抑制氧化應激所致的細胞自噬水平活化,闡明了mi R-210作為上游因子通過直接抑制其靶基因BNIP3的蛋白表達來發(fā)揮細胞保護作用。本研究為心肌細胞氧化應激損傷提供新的實驗證據(jù),為mi R-210在心血管疾病中的保護作用提供理論基礎,為進一步臨床中診斷和治療提供新的思路。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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本文編號：2375853