【摘要】：研究背景動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)是一種累及動脈血管壁的由脂質(zhì)代謝異常引起的慢性免疫炎癥性疾病。目前在全球范圍內(nèi),由AS引發(fā)的心腦血管疾病始終處于疾病死亡譜的前列。AS是冠狀動脈疾病(Coronary Artery Disease, CAD)、腦卒中(Stroke)、動脈瘤(Aneurysm)及外周動脈疾病(Peripheral Artery Disease)的共同病理學(xué)基礎(chǔ)。AS隸屬復(fù)雜疾病,是由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用產(chǎn)生的結(jié)果。AS的發(fā)病機制目前尚不明確,而對AS遺傳機制的詳細闡釋亦處于起步階段。憑借全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome Wide Association Study, GWAS)技術(shù),目前人類發(fā)現(xiàn)的AS易感基因或位點有50個以上,然而多數(shù)尚未得到穩(wěn)健驗證,其功能相關(guān)性也不甚清楚。2007年的一項針對支氣管哮喘(Bronchial Asthma,下面簡稱哮喘)的GWAS證實ORMDL3基因(ORMDL sphingolipid biosynthesis regulator 3)為哮喘的易感基因,這一結(jié)果后在全球多個人群中得以驗證。之后研究人員發(fā)現(xiàn)ORMDL3基因與其他幾種自身免疫疾病如1型糖尿病(Type Ⅰ Diabetes)和炎癥性腸炎(Inflammatory Bowel Disease, IBD)的發(fā)病風險相關(guān)聯(lián)。而對該基因的功能研究亦取得許多進展,研究人員發(fā)現(xiàn)ORMDL3在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum Stress, ERS)／未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded Protein Response, UPR)、炎癥反應(yīng)及脂質(zhì)代謝等過程中發(fā)揮重要作用,而這些機制在AS發(fā)病中同樣有重要意義�？紤]到免疫性疾病常有相似的致病機制或遺傳重疊(Genetic Overlap),故有必要嘗試研究ORMDL3基因是否與AS風險相關(guān)并深入探索其可能的調(diào)控手段。在復(fù)雜疾病中,通過遺傳關(guān)聯(lián)分析尋找到易感基因或位點后,繼續(xù)功能研究探索主要調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是當前的主要挑戰(zhàn)之一。自噬(Autophagy,本文討論的是巨自噬,下面簡稱自噬)是一種進化保守的分解代謝機制,其通過調(diào)控溶酶體降解胞內(nèi)有形成分以維持細胞穩(wěn)態(tài)并促進細胞生存。在細胞應(yīng)對外界“惡劣環(huán)境”或病理刺激時,自噬過程得以啟動并放大。有趣的是,經(jīng)典的自噬誘導(dǎo)因素即包括ERS/UPR、炎癥以及脂質(zhì)代謝異常等,而這些機制已被證實與ORMDL3基因的功能關(guān)系密切,這提示該基因可能參與自噬的調(diào)控。現(xiàn)在認為自噬異常在多種疾病中可能扮演關(guān)鍵角色,包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病(Neurodegenerative Disease)、微生物感染及AS等。由于自噬調(diào)控的復(fù)雜性及研究手段的局限性,自噬在AS中的作用目前尚不明確。一般認為自噬具有抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗凋亡等多種功能,故其可抑制AS；但亦有證據(jù)表明過度自噬可加速AS的發(fā)生發(fā)展。因此亟待發(fā)現(xiàn)新的自噬相關(guān)基因(Autophagy-Associated Gene)以幫助我們揭開自噬現(xiàn)象的神秘面紗并闡明自噬在疾病中的作用。另外很多證據(jù)表明精確觀測并精密調(diào)控自噬,是未來值得期待的疾病診療手段�；谏鲜�,我們有理由去探索ORMDL3基因是否可能作為自噬相關(guān)基因參與AS過程的調(diào)控。此外,AS斑塊細胞炎癥及凋亡始終是AS研究的重點和熱點問題。由于ORMDL3已知功能與炎癥及ERS/UPR密切相關(guān),而二者在AS中是凋亡的促進因素,因此亦需深究ORMDL3是否通過調(diào)控炎癥和凋亡在AS的發(fā)病機制中發(fā)揮功能。本研究中我們將以血管內(nèi)皮細胞(Endothelial Cell, EC)作為研究對象,探索)RMDL3基因與AS易感的關(guān)系并尋找可能的致病機制。為此我們提出如下問題：第一,ORMDL3基因所在區(qū)域的遺傳多態(tài)位點是否與AS的發(fā)病風險存在統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)；第二,在AS背景下ORMDL3是否具有調(diào)控EC自噬的作用；第三,ORMDL3與EC凋亡和炎癥過程有何關(guān)系。在本研究中我們將會著力探索上述問題。研究目的1、在中國漢族人群中運用遺傳關(guān)聯(lián)分析探討0RMDL3基因所在區(qū)域17q12內(nèi)兩個單核苷酸多態(tài)位點(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)與AS易感的關(guān)系；同時,探究AS病例與健康對照外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC) ORMDL3基因表達的差異；此外,探明上述SNP不同基因型與PBMC ORMDL3基因表達的關(guān)系。2、探究氧化低密度脂蛋白(Oxidized Low-Density Lipoprotein, ox-LDL)能否調(diào)控ORMDL3基因表達并誘導(dǎo)EC自噬；在ox-LDL刺激下沉默ORMDL3基因的表達,以明確該基因在ox-LDL誘導(dǎo)的EC自噬中的作用及可能機制。另外嘗試驗證ORMDL3在EC基礎(chǔ)自噬和饑餓誘導(dǎo)自噬中的作用。3、同上,在ox-LDL刺激EC并干擾ORMDL3基因表達的基礎(chǔ)上,探明該基因在ox-LDL誘導(dǎo)的EC凋亡和炎癥中的角色。研究材料和方法1、在遺傳關(guān)聯(lián)分析中納入來自中國漢族人群的CAD病例和健康對照,收集樣本PBMC并提取DNA后,對兩個SNP位點rs7216389與rs9303277進行基因分型并做統(tǒng)計處理,以確定基因型與CAD發(fā)病是否存在統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)；同時提取樣本PBMC總RNA和蛋白后,以實時定量及免疫印跡技術(shù)檢測ORMDL3基因mJRNA水平和蛋白水平的表達情況,分析CAD病例與對照之間基因表達是否有差異；另外在1nRNA水平上明確上述SNP位點不同基因型攜帶者之間基因表達是否有差異。2、選取人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC)和人主動脈血管內(nèi)皮細胞(Human Aortic Endothelial Cell, HAEC)作為研究對象,以實時定量及免疫印跡檢測ORMDL3基因mRNA和蛋白表達情況,以免疫印跡檢測自噬標志物MAPLC3B、SQSTM1/P62及BECN1蛋白水平,以免疫熒光檢測LC3焦點形成。在ox-LDL刺激HUVEC和HAEC的基礎(chǔ)上,明確ox-LDL能否影響ORMDL3基因表達,并利用短發(fā)卡RNA(Short Hairpin RNA, shRNA)沉默ORMDL3基因,以闡明ORMDL3在ox-LDL誘導(dǎo)的EC自噬中的作用。此外明確ORMDL3在EC基礎(chǔ)自噬和血清饑餓誘導(dǎo)的自噬中的作用。3、選取HUVEC為研究對象,以免疫印跡檢測凋亡標志物Cleaved Caspase 3和Cleaved PARP蛋白水平,以流式細胞術(shù)檢測凋亡細胞比例,以CCK-8試驗檢測細胞活性,以實時定量技術(shù)檢測炎癥因子TNF (Tumor Necrosis Factor)、 IL(Interleukin)-6及IL-17A等炎癥因子mRNA表達水平。在ox-LDL刺激HUVEC和shRNA干擾ORMDL3表達的基礎(chǔ)上,探索ORMDL3在ox-LDL誘導(dǎo)EC凋亡和炎癥中的作用。研究結(jié)果第一部分ORMDL3基因與中國漢族人群動脈粥樣硬化易感的遺傳關(guān)聯(lián)分析在本部分中,為研究中國漢族人群ORMDL3基因所在區(qū)域內(nèi)SNP位點rs7216389和rs9303277與AS發(fā)病風險是否存在關(guān)聯(lián),在以病例-對照設(shè)計為核心的遺傳關(guān)聯(lián)分析中,我們共納入來自中國北方漢族人群和中國南方漢族人群的CAD病例1829例及健康對照1806例。在年齡及性別方面,CAD病例組及對照組未見差異。病例組身體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Index, BMI)、吸煙者比例、血甘油三酯、總膽固醇及LDL水平顯著高于對照組；病例組HDL水平顯著低于對照組。在上述兩個研究人群的病例和對照組中,兩個SNP位點的分型結(jié)果未偏離哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium, HWE) (P0.05)。在中國北方漢族人群中,CAD病例組rs7216389 T等位基因與rs9303277 C等位基因頻率顯著高于對照組(rs7216389:71.77% vs.67.07%; rs9303277:68.50% vs.64.66%)。在校正年齡、性別、BMI、血脂指標及吸煙等因素之后,rs7216389與rs9303277位點與CAD患病風險顯著相關(guān)(rs7216389:P=0.003; rs9303277: P=0.017)。攜帶rs7216389 T等位基因或rs9303277 C等位基因的個體表現(xiàn)出更高的CAD患病風險(rs7216389:odds ratio [OR] 0.80,95% confidence interval [CI] 0.69-0.93; rs9303277:OR 0.84,95% CI 0.73-0.97).同樣在中國南方漢族人群中,我們發(fā)現(xiàn)CAD病例組rs7216389 T等位基因與rs9303277 C等位基因頻率亦顯著高于對照組(rs7216389:75.22% vs.71.38%; rs9303277:75.72% vs.72.28%)。校正上述協(xié)變量之后,rs7216389與rs9303277位點仍與CAD患病風險顯著相關(guān)(rs7216389:P=0.009; rs9303277:P=0.022)。攜帶rs7216389 T等位基因或rs9303277 C等位基因的個體罹患CAD風險更高Crs7216389:OR 0.82,95% CI 0.71-0.95; rs9303277:OR 0.84,95% CI 0.72-0.97)。之后,為探討上述ORMDL3基因SNP位點與基因表達的關(guān)系,首先我們提取89例患者的PBMC總RNA后以實時定量檢測ORMDL3基因mRNA水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶上述兩個SNP風險等位基因的個體ORMDL3基因nRNA表達水平顯著高于參考等位基因(Reference Allele)純合子攜帶者(rs7216389,P=0.012; rs9303277, P=0.004)。之后我們檢測并比較37例病例與37例對照PBMC ORMDL3基因mRNA水平,發(fā)現(xiàn)病例ORMDL3基因mRNA表達顯著高于對照(P=0.003)；而以免疫印跡檢測4例病例與4例對照PBMC ORMDL3基因蛋白表達亦得出一致結(jié)論(P=0.034)。第二部分ORMDL3在動脈粥樣硬化中對內(nèi)皮細胞自噬的調(diào)控以ox-LDL刺激HUVEC和HAEC,我們發(fā)現(xiàn)ox-LDL可以時間依賴(100μg/ml,處理0、4、8和12h)與劑量依賴(0、50和100μg/ml,處理12h)地上調(diào)ORMDL3基因nRNA和蛋白水平的表達。之后我們研究了ox-LDL誘導(dǎo)EC自噬過程的細節(jié),發(fā)現(xiàn)在HUVEC和HAEC中,ox-LDL可以時間依賴(100μg/ml,處理0、4、8和12h)與劑量依賴(0、50和100μg/ml,處理12h)地上調(diào)自噬標志物LC3B-Ⅱ蛋白表達水平；ox-LDL可以促進SQSTM1/P62的累積；同時免疫熒光示ox-LDL刺激促進HUVEC LC3焦點的形成；而ox-LDL與氯喹(50μM)共同刺激HUVEC可進一步加強LC3B-II和SQSTM1/P62蛋白累積。上述結(jié)果證明了ox-LDL可促進EC自噬過程。為研究ORMDL3是否調(diào)控EC自噬,我們利用shRNA干擾HUVEC ORMDL3表達,結(jié)果證實基因干擾效率較高。干擾ORMDL3可以導(dǎo)致HUVEC細胞本底自噬水平降低；另外干擾ORMDL3可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的自噬強度。另外我們發(fā)現(xiàn)血清饑餓6h處理可引起HUVEC細胞較高的自噬水平,而干擾ORMDL3還可降低血清饑餓(6h)誘導(dǎo)的自噬水平(即都表現(xiàn)為LC3B-Ⅱ轉(zhuǎn)化減少及SQSTM1/P62累積增多)。上述結(jié)果表明AS中,ORMDL3在異常脂質(zhì)代謝誘導(dǎo)的EC自噬中可能發(fā)揮重要作用；其也同樣可能與EC基礎(chǔ)自噬和饑餓誘導(dǎo)的自噬有關(guān)。BECN1是重要的自噬正調(diào)控分子之一。我們發(fā)現(xiàn)干擾ORMDL3不僅可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的BECN1蛋白表達,還可下調(diào)細胞本底和饑餓誘導(dǎo)的BECN1蛋白表達,這說明ORMDL3可能通過BECN1調(diào)控自噬。另外我們發(fā)現(xiàn)干擾ORMDL3并不能引起HUVEC p-mTOR/mTOR及p-AMPK/AMPK比值的變化。綜上所述,在ox-LDL介導(dǎo)的EC自噬中,可能存在ox-LDL-ORMDL3-BECN1-自噬的調(diào)控方式；而ORMDL3可能在生理性或病理性自噬反應(yīng)中都發(fā)揮重要作用。第三部分ORMDL3在動脈粥樣硬化中對內(nèi)皮細胞凋亡和炎癥的影響ox-LDL是一種強凋亡誘導(dǎo)劑,我們發(fā)現(xiàn)ox-LDL處理(100μg/ml,處理12h)可誘導(dǎo)HUVEC凋亡發(fā)生,表現(xiàn)為凋亡標志物Cleaved PARP與Cleaved Caspase3蛋白表達上調(diào)。而在基礎(chǔ)水平上,沉默ORMDL3后HUVEC Cleaved PARP與Cleaved Caspase 3蛋白表達同樣上調(diào)。之后我們發(fā)現(xiàn)與對照相比,干擾ORMDL3后HUVEC對ox-LDL的促凋亡毒性更為敏感,表現(xiàn)為Cleaved PARP與Cleaved Caspase 3蛋白表達進一步上調(diào),CCK-8試驗示細胞活力進一步減低,而流式細胞術(shù)示凋亡細胞比例明顯增多。此外ox-LDL可有效促進EC炎癥反應(yīng),我們發(fā)現(xiàn)沉默ORMDL3可部分逆轉(zhuǎn)ox-LDL誘導(dǎo)的TNF和IL-17AmRNA表達,而IL-6表達未見改變。上述這些結(jié)果提示ORMDL3可能作為凋亡和炎癥調(diào)控因子參與AS發(fā)生發(fā)展。研究結(jié)論1、ORMDL3基因所在17q12區(qū)域2個SNP位點rs7216389和rs9303277與中國漢族人群AS易感及ORMDL3基因表達相關(guān)聯(lián)。此外該基因在CAD患者中表達顯著高于對照。這些結(jié)果提示在中國漢族人群中ORMDL3基因可能是AS的一個易感基因。2、ORMDL3不僅參與調(diào)控ox-LDL誘導(dǎo)的EC自噬,也在EC基礎(chǔ)自噬和饑餓誘導(dǎo)自噬中發(fā)揮作用。這說明ORMDL3可能是一個重要的自噬相關(guān)基因,其調(diào)控自噬的詳細機制目前尚不明確。3、ORMDL3可能具有抗凋亡的功能,但是關(guān)于ORMDL3如何影響凋亡及其與自噬的關(guān)系仍存諸多疑問。此外ORMDL3可能在AS炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R543.5
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本文編號：2375804