【摘要】：目的：探討自噬在IFN-γ促進FasL誘導血管平滑肌細胞凋亡中的作用及其相關分子機制。方法：獲取SD大鼠胸主動脈,應用貼壁法分離并培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞,分別給予IFN-γ或／和FasL處理,采用細胞計數(shù)、FCM檢測以及蛋白印跡實驗分析法等實驗方法,檢測不同處理因素對血管平滑肌細胞凋亡的影響。采用免疫熒光和蛋白印跡等檢測方法,明確IFN-γ對血管平滑肌細胞自噬的誘導作用,并探討自噬與IFN-γ聯(lián)合FasL誘導血管平滑肌細胞凋亡中的作用,采用FCM檢測血管平滑肌細胞表面Fas的蛋白水平,并用自噬抑制劑預處理細胞,探討明確自噬與血管平滑肌細胞膜表面Fas表達的中的作用。用慢病毒介導轉染FAP-1 shRNA以敲低FAP-1表達,用蛋白印跡實驗分析檢測載體用于細胞感染,獲得FAP-1低表達血管平滑肌細胞并用于實驗。以蛋白印跡實驗分析和FCM檢測血管平滑肌細胞內(nèi)和膜表面Fas表達的水平,以明確FAP-1對細胞膜表面Fas表達以及IFN-γ聯(lián)合FasL誘導調(diào)控細胞凋亡的影響。采用蛋白印跡實驗分析Jak2/STAT1信號通路介導IFN-γ對細胞自噬調(diào)節(jié)作用。最后,再以不同抑制劑預處理平滑肌細胞,檢測在抑制劑存在的情況下,采用FCM分析IFN-γ對細胞膜表面Fas表達的影響,探討IFN-γ導血管平滑肌細胞自噬及Fas膜轉運的的分子機制。結果：IFN-γ或FasL的單獨處理血管平滑肌細胞并不能誘導明顯細胞凋亡,然而,兩者聯(lián)合作用可明顯引起平滑肌細胞凋亡。IFN-γ處理后可以觀察到血管平滑肌細胞內(nèi)FAP-1的水平降低以及和細胞膜表面的Fas的表達增加,而自噬抑制劑預處理細胞能有效阻斷IFN-γ對FAP-1表達及細胞膜表面Fas蛋白水平的調(diào)節(jié)作用。同樣,敲低FAP-1基因表達也能使血管平滑肌細胞膜表面Fas的表達水平顯著增加。此外,血管平滑肌細胞經(jīng)IFN-γ處理,可導致Jak2及STAT1的磷酸化水平增加,但是使用Jak和STAT1的抑制劑后,分別預處理細胞,能有效抑制IFN-y誘導細胞自噬和Fas膜表面轉運。結論：IFN-y聯(lián)合FasL可誘導大鼠血管平滑肌細胞凋亡,而凋亡機制的調(diào)控主要是由IFN-y通過活化Jak2/STAT1信號通路,下調(diào)血管平滑肌細胞內(nèi)FAP-1的表達,從而促進細胞內(nèi)Fas向膜表面轉運,增強FasL誘導的細胞凋亡。
[Abstract]:Aim: to investigate the role of autophagy in IFN- 緯 -induced apoptosis of vascular smooth muscle cells (VSMC) induced by FasL and its molecular mechanism. Methods: the thoracic aorta of SD rats was obtained. Primary vascular smooth muscle cells were isolated and cultured by adherent method. The primary vascular smooth muscle cells were treated with IFN- 緯 or / and FasL respectively. Cell count, FCM detection and Western blot analysis were used. The effects of different treatment factors on the apoptosis of vascular smooth muscle cells were detected. The effects of IFN- 緯 on autophagy of vascular smooth muscle cells (VSMCs) were determined by immunofluorescence and Western blotting, and the role of autophagy combined with IFN- 緯 in inducing apoptosis of VSMCs was discussed. The protein level of Fas on vascular smooth muscle cells was detected by FCM, and the expression of Fas on the surface of vascular smooth muscle cells was determined with autophagy inhibitor to investigate the role of Fas expression on the surface of vascular smooth muscle cells. FAP-1 shRNA was transfected by lentivirus to lower the expression of FAP-1. Western blot analysis was used to detect the vector for cell infection. Vascular smooth muscle cells (VSMC) with low expression of FAP-1 were obtained and used in the experiment. The expression of Fas in vascular smooth muscle cells (VSMC) was detected by Western blot and FCM to determine the effect of FAP-1 on the expression of Fas on the cell membrane and the apoptosis induced by IFN- 緯 combined with FasL. The effects of Jak2/STAT1 signaling pathway mediated by IFN- 緯 on autophagy were analyzed by Western blot. Finally, the smooth muscle cells were pretreated with different inhibitors to detect the effect of IFN- 緯 on the expression of Fas on the surface of the cell membrane by FCM analysis in the presence of the inhibitor. To investigate the molecular mechanism of autophagy and Fas membrane transport in vascular smooth muscle cells (VSMCs) induced by IFN- 緯. Results: IFN- 緯 or FasL alone could not induce apoptosis of vascular smooth muscle cells. After IFN- 緯 treatment, the level of FAP-1 in vascular smooth muscle cells decreased and the expression of Fas on the surface of the vascular smooth muscle cells increased. Autophagy inhibitor pretreatment could effectively block the regulation of FAP-1 expression and Fas protein level on cell membrane surface by IFN- 緯. Similarly, knockout of FAP-1 gene can significantly increase the expression of Fas on the surface of vascular smooth muscle cells. In addition, IFN- 緯 treatment of vascular smooth muscle cells resulted in increased phosphorylation of Jak2 and STAT1. However, pretreatment with Jak and STAT1 inhibitors could effectively inhibit IFN-y induced autophagy and Fas surface transport. Conclusion: IFN-y combined with FasL can induce apoptosis of rat vascular smooth muscle cells, and the mechanism of apoptosis is that IFN-y down-regulates the expression of FAP-1 in vascular smooth muscle cells by activating Jak2/STAT1 signaling pathway. Thus, Fas transport to the membrane surface was promoted and apoptosis induced by FasL was enhanced.
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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