【摘要】：免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)是一種免疫介導(dǎo)的血小板減少性疾病,約占臨床出血性疾病的30%,以外周血血小板減少(100×109/L)、易出血和出血傾向?yàn)橹饕R床表現(xiàn)。原發(fā)性ITP的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,主要為機(jī)體免疫耐受失衡,免疫系統(tǒng)對(duì)自身血小板和巨核細(xì)胞破壞增加,導(dǎo)致骨髓巨核細(xì)胞發(fā)育成熟障礙和血小板生成減少以及外周血小板破壞增多。其中,自身免疫性B細(xì)胞及其產(chǎn)生的血小板特異性自身抗體在ITP血小板病理性破壞過(guò)程中起到重要作用。自身抗體與血小板表面的糖蛋白結(jié)合,通過(guò)結(jié)和巨噬細(xì)胞表面的Fcy受體使血小板在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的破壞增加。此外,T細(xì)胞凋亡異常、T細(xì)胞亞群比例失調(diào)以及細(xì)胞毒性T細(xì)胞直接介導(dǎo)的血小板溶解等也在ITP發(fā)病中起到重要作用。隨著人們對(duì)于B細(xì)胞活化因子(B cell activating factor,BAFF,亦稱作BLyS, TALL-1,THANK,zTNF4,TNFSF13B)及其受體(BAFF-R,TACI和BCMA)在淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生(尤其是B細(xì)胞)、免疫耐受的建立以及免疫反應(yīng)調(diào)控中作用的認(rèn)識(shí)不斷深入,BAFF/BAFF受體系統(tǒng)在自身免疫性疾病發(fā)病中的作用日漸受到重視。既往研究發(fā)現(xiàn),BAFF過(guò)度表達(dá)是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)、干燥綜合征以及系統(tǒng)性硬化等多種自身免疫性疾病發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。迄今為止,非特異性免疫抑制療法依然是治療ITP的一線方案。近十余年來(lái)利妥昔單抗(rituximab)清除B細(xì)胞被廣泛接受作為ITP的二線治療方案,且越來(lái)越受到人們的重視。盡管其與之前的治療方案相比緩解維持時(shí)間明顯延長(zhǎng),但該治療措施仍存在感染率高、起效過(guò)緩等不足之處。2011年,一種能中和BAFF的生物制齊—belimumab—-作為治療SLE的新選擇,成為第一種臨床試驗(yàn)證實(shí)有效的SLE靶向治療藥物,這開(kāi)啟了自身免疫性疾病特異性免疫調(diào)節(jié)治療的新紀(jì)元。本研究旨在探討B(tài)AFF及其受體在慢性ITP患者不同免疫器官(或組織)的表達(dá)情況和功能異常,從細(xì)胞和分子水平探討B(tài)AFF/BAFF受體系統(tǒng)在ITP發(fā)病中的作用,從而完善我們對(duì)于ITP發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí),并為ITP特異性免疫調(diào)節(jié)性治療提供可能的新思路。第一部分慢性ITP患者BAFF體系的異常表達(dá)及其意義研究背景BAFF作為一種重要的B細(xì)胞存活因子,不僅廣泛參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞發(fā)育、分化及抗體的產(chǎn)生,而且還在T細(xì)胞的活化和免疫應(yīng)答過(guò)程中的類型轉(zhuǎn)化及細(xì)胞因子的分泌起調(diào)節(jié)作用。既往許多研究已經(jīng)證實(shí),以系統(tǒng)性紅斑狼瘡為代表的多種自身免疫性疾病患者外周血中可溶性BAFF(soluble BAFF,sBAFF)的水平較健康人群明顯升高,說(shuō)明BAFF的過(guò)量表達(dá)是自身免疫性疾病發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素。BAFF的免疫調(diào)節(jié)作用是通過(guò)細(xì)胞表面的三種受體介導(dǎo)完成的,他們分別是BAFF-特異受體(B-cell activation factor receptor,BAFF-R,亦稱BR3,TNFRSF 13C),轉(zhuǎn)膜激活劑、鈣調(diào)節(jié)劑和親環(huán)素配體相互作用物(transmembrane activator and calcium-modulating cyclophilin ligand interactor, TACI，，亦稱TNFRSF13B)和B細(xì)胞成熟抗原(B-cell maturation antigen,BCMA,亦稱TNFRSF17)。BAFF-R 是 BAFF的特異性受體,而TACI和BCMA也是另一種細(xì)胞因子—增殖誘導(dǎo)配體(a proliferation-inducing ligand,APRIL)的受體。雖然已有實(shí)驗(yàn)室和臨床數(shù)據(jù)顯示慢性ITP患者外周血sBAFF水平明顯升高且其升高程度與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。但是,目前對(duì)于BAFF體系在ITP患者體內(nèi)免疫失耐受過(guò)程中的作用尚不清楚,而B(niǎo)AFF受體介導(dǎo)BAFF調(diào)節(jié)作用的具體機(jī)制仍待明確。目的檢測(cè)慢性ITP患者及缺鐵性貧血(iron deficiency anemia,IDA)患者骨髓上清sBAFF及其受體在不同分化階段的B淋巴系細(xì)胞表面表達(dá)情況；研究BAFF受體在脾臟內(nèi)的分布情況并對(duì)比ITP脾切除患者和外傷致脾破裂(traumatic spleen rupture,TSR)患者脾臟內(nèi)三種受體的表達(dá)差異,比較兩種患病人群脾臟不同發(fā)育階段B細(xì)胞表面三種BAFF受體的表達(dá)情況；分析外周血BAFF/BAFF受體系統(tǒng)在慢性ITP患者及健康對(duì)照不同淋巴細(xì)胞亞群中的表達(dá)差異。通過(guò)對(duì)比不同人群各淋巴器官BAFF體系的表達(dá)情況,總結(jié)慢性ITP患者體內(nèi)BAFF體系的表達(dá)特征,從而明確ITP患者體內(nèi)BAFF/BAFF受體系統(tǒng)在淋巴細(xì)胞發(fā)育(免疫失耐受的建立)及血小板相關(guān)自身免疫應(yīng)答過(guò)程中的作用。方法抽取36例慢性ITP患者及27例IDA患者骨髓,26例慢性ITP患者及22例健康對(duì)照外周血,分離血漿和單個(gè)核細(xì)胞。收集13例ITP脾切除患者及8例外傷致脾破裂行脾切手術(shù)患者的脾臟組織及脾臟單個(gè)核細(xì)胞。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunoadsorbent assay,ELISA)檢測(cè)骨髓上清和外周血漿中BAFF和APRIL的濃度；實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測(cè)BAFF及BAFF受體mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。改良單克隆抗體特異性俘獲血小板抗原(monoclonal antibody immobilization of platelet antigens,MAIPA)技術(shù)檢測(cè)骨髓IgG、IgM型抗GPⅡb/Ⅲa和GP I b/XI自身抗體水平。流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測(cè)骨髓、脾臟和外周血不同分化及發(fā)育階段B淋巴系細(xì)胞表面三種BAFF受體的表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)染色法(immunohistochemistry,IHC)和免疫熒光(immunofluorescence,IF)技術(shù)檢測(cè)脾臟BAFF受體的分布和表達(dá)情況。結(jié)果1 慢性ITP患者骨髓、脾臟以及外周單個(gè)核細(xì)胞BAFF表達(dá)明顯增高1.1 在mRNA水平,慢性ITP患者骨髓、脾臟及外周血單個(gè)核細(xì)胞BAFF表達(dá)水平顯著高于其各自對(duì)照組。1.2慢性ITP患者骨髓上清sBAFF 和 APR IL水平較對(duì)照組明顯升高。慢性活I(lǐng)TP患者外周血血漿sBAFF水平較健康對(duì)照顯著增升高。1.3慢性ITP患者骨髓上清sBAFF濃度與CD10-B細(xì)胞表面BCMA陽(yáng)性率呈正相關(guān)；APRIL濃度與患者骨髓上清IgM型抗GPⅡb/Ⅲa自身抗體濃度呈正相關(guān)。2 三種BAFF受體在骨髓各發(fā)育階段B系淋巴細(xì)胞表面的異常表達(dá)。根據(jù)B淋巴系細(xì)胞在骨髓中的各個(gè)分化階段,將骨髓B淋巴系細(xì)胞分成B前細(xì)胞(包括祖B細(xì)胞和前B細(xì)胞)、B細(xì)胞以及漿細(xì)胞三個(gè)階段。流式結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),2.1 慢性ITP患者B前細(xì)胞表面BAFF-R陽(yáng)性率顯著低于IDA患者。2.2慢性ITP患者成熟B細(xì)胞表面BCMA的陽(yáng)性表達(dá)率以及漿細(xì)胞表面TACI陽(yáng)性率均明顯高于對(duì)照組3 BAFF受體在ITP患者脾臟內(nèi)的異常表達(dá)3.1 通過(guò)IHC染色,我們發(fā)現(xiàn)首先明確了三種BAFF受體在脾臟的分布特征。BAFF-R在白髓區(qū)廣泛表達(dá),但存在兩種不同的表達(dá)形式：動(dòng)脈周?chē)馨颓蕝^(qū)(periaterial lymphatic sheath,PALS)和濾泡區(qū)(follicular zone,FO)僅有少數(shù)散在分布的BAFF-R陽(yáng)性細(xì)胞,但B AFF-R著色較強(qiáng)；邊緣區(qū)(marginal zone,MZ)有相對(duì)PALS較弱但廣泛分布的BAFF-R染色；TACI陽(yáng)性細(xì)胞散在分布在PALS及紅髓區(qū)；BCMA在紅髓和白髓均有少量散在細(xì)胞表達(dá),無(wú)固定的分布模式。3.2 通過(guò)對(duì)IHC染色的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)ITP患者脾臟FO以及MZ區(qū)BAFF-R的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于TSR患者。3.3 IF染色進(jìn)一步明確了ITP患者淋巴濾泡周?chē)鷧^(qū)中BAFF-R表達(dá)異常增高的細(xì)胞同時(shí)高表達(dá)IgM。3.4通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)化不同發(fā)育階段的B細(xì)胞分別進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)ITP患者M(jìn)Z區(qū)B細(xì)胞表面BAFF-R的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity,MFI)明顯高于對(duì)照組。而FO區(qū)和PALS區(qū)B細(xì)胞表面三種受體表達(dá)無(wú)顯著差異。此外,慢性ITP患者脾臟CD4+記憶T細(xì)胞和CD8+記憶T細(xì)胞表面MFIBAFF-R及MFITACI均較對(duì)照組相應(yīng)的淋巴下表亞群明顯增高。4 慢性ITP患者BAFF受體在外周血淋巴細(xì)胞亞群的異常表達(dá)4.1 通過(guò)免疫磁珠分選技術(shù)分別陽(yáng)性選取慢性ITP患者以及健康對(duì)照外周CD19+、CD4+以及CD8+淋巴細(xì)胞并進(jìn)行RT-PCR分析。結(jié)果顯示兩組研究對(duì)象各淋巴細(xì)胞亞群三種BAFF受體的表達(dá)在mRNA水平不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4.2 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù),我們發(fā)現(xiàn)慢性ITP患者表面BAFF-R陽(yáng)性率較健康對(duì)照顯著降低。與之相反的是,病號(hào)組B細(xì)胞MFITACI顯著高于健康對(duì)照組。同時(shí),B細(xì)胞表面BAFF-R陽(yáng)性率與外周血漿sBAFF濃度呈線性負(fù)相關(guān)。結(jié)論1 在慢性ITP患者的骨髓中,BAFF和APRIL均參與了血小板相關(guān)自身免疫反應(yīng),然而介導(dǎo)兩種細(xì)胞因子作用的受體有所不同,前者主要通過(guò)BCMA發(fā)揮作用,而后者通過(guò)TACI提高了漿細(xì)胞對(duì)自身抗血小板抗體的分泌。2 ITP患者脾臟過(guò)度表達(dá)的BAFF與自身反應(yīng)性B細(xì)胞表面相應(yīng)的受體結(jié)合而協(xié)其免疫逃逸,是ITP患者B細(xì)胞免疫耐受失衡的重要機(jī)制之一。此外,ITP患者邊緣區(qū)B細(xì)胞BAFF-R表達(dá)顯著上調(diào),能通過(guò)與該區(qū)非自身免疫性B淋巴細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合BAFF而抑制自身的凋亡,這是ITP患者B淋巴細(xì)胞免疫耐受失衡的另一可能機(jī)制。3 ITP患者外周血各淋巴細(xì)胞亞群表面BAFF-R表達(dá)顯著低于健康人群,可能與外周血血漿sBAFF水平明顯增高有關(guān)。意義通過(guò)系統(tǒng)性分析BAFF及其受體在B淋巴細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育以及免疫應(yīng)答等不同階段的各淋巴組織和器官內(nèi)表達(dá)情況,揭示了BAFF體系的表達(dá)異常導(dǎo)致ITP患者體內(nèi)B系淋巴細(xì)胞在生成、發(fā)育及免疫應(yīng)答過(guò)程中的免疫耐受失衡的可能作用機(jī)制。第二部分BAFF/BAFF受體系統(tǒng)在ITP血小板特異性免疫反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用研究背景及目的既往實(shí)驗(yàn)證實(shí),BAFF既能促進(jìn)B細(xì)胞的抗體分泌,也為T(mén)淋巴細(xì)胞在免疫反應(yīng)中的活化提供重要的共刺激信號(hào)。通過(guò)第一部分的研究,我們發(fā)現(xiàn)BAFF及其受體在ITP患者不同淋巴器官和組織中的表達(dá)存在顯著異常。此外,我們還發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段以及不同亞群的淋巴細(xì)胞表面BAFF受體表達(dá)的情況各有差異。其中,脾臟作為ITP患者自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞初始免疫應(yīng)答以及血小板免疫性破壞的主要部位,BAFF及其特異性受體BAFF-R的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組人群。因此,為了進(jìn)一步探討三種BAFF受體在血小板免疫過(guò)程中扮演的各自角色,我們建立了一個(gè)血小板反應(yīng)性的體外培養(yǎng)體系,同時(shí)利用特異性抗體對(duì)淋巴細(xì)胞表面的三種BAFF受體分別進(jìn)行功能性阻斷,從而進(jìn)一步研究BAFF及其受體在ITP血小板特異性免疫反應(yīng)中的作用。方法分別采集33名慢性ITP患者及28名健康對(duì)照外周血CD14-單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMNCs)并其分為BAFF組、BAFF-R組、TACI組、BCMA組及對(duì)照組。各組分別加入不同BAFF受體阻斷抗體,從而對(duì)外周淋巴細(xì)胞表面的BAFF受體進(jìn)行功能性阻斷。負(fù)荷血小板抗原的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)的誘導(dǎo)：免疫磁珠分選CD14+單核細(xì)胞,用重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage stimulating factor, rhGM-FSF;1000 U/mL).重組人白細(xì)胞介素-4(recombinant human inteleukin-4, rhIL-4;1000 U/mL)以及自身過(guò)期血小板(1×106/mL)培養(yǎng)5天,培養(yǎng)后的未成熟DC培養(yǎng)體系加入重組人腫瘤壞死因子-α(recombinant human tumor necrosis factor-a, rhTNF-a; 500 U/mL)培養(yǎng)2天以誘導(dǎo)成熟建立血小板特異性混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction,MLR)體系：負(fù)荷血小板抗原的成熟DCs與BAFF受體功能性阻斷后的淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)(DCs:PBMNCs:1:10)。流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)檢測(cè)血小板特異性MLR體系中各淋巴細(xì)胞亞群的凋亡、增殖、活化以及轉(zhuǎn)化的情況；流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)培養(yǎng)后淋巴細(xì)胞各凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況。體外培養(yǎng)血小板膜糖蛋白(glycoprotein,GP) Ⅱb/Ⅲa反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增：在重組人白細(xì)胞介素(recombinant human interleukin-2,rhIL-2; 50U/mL)的刺激下,外周單個(gè)核細(xì)胞與血小板Ⅱb/Ⅲa(10μg/mL)抗原共培養(yǎng)5天。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunoadsorbent assay,ELIS A)檢測(cè)培養(yǎng)上清中BAFF、APRIL、干擾素-γ (interferon-γ, IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、IL-4、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)及腫瘤壞死因子-β1(tumor necrosis factor-p,TNF-β1)濃度。選取另外23名GPⅡb/Ⅲa自身抗體陽(yáng)性的慢性ITP患者以及20名健康對(duì)照,流式檢測(cè)其活化和未活化的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa反應(yīng)性淋巴細(xì)胞表面三種BAFF受體的表達(dá)情況。結(jié)果1 BAFF/BAFF-R信號(hào)通路對(duì)免疫效應(yīng)細(xì)胞的作用1.1 無(wú)論是慢性ITP患者還是健康人BAFF組和BAFF-R組CD19+B細(xì)胞凋亡較對(duì)照組明顯降低。慢性ITP患者BAFF組和BAFF-R組B細(xì)胞增殖較對(duì)照組顯著增強(qiáng)。1.2慢性ITP患者BAFF組和BAFF-R組CD8+T細(xì)胞凋亡較對(duì)照組明顯降低。1.3慢性ITP患者BAFF及BAFF-R組B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞胞內(nèi)Bcl-2、 Bcl-XL(僅B細(xì)胞)表達(dá)明顯高于對(duì)照組。1.4慢性ITP患者BAFF組和BAFF-R組CD19+B田胞表面CD25和CD86表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)；而CD80陽(yáng)性率在同一人群的五組細(xì)胞間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2 BAFF/TACI信號(hào)通路對(duì)T細(xì)胞功能的作用2.1 慢性ITP患者BAFF組和TACI組CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞增殖較基線組明顯增強(qiáng)2.2慢性ITP患者TACI組CD4+和CD8+效應(yīng)型記憶T細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組。2.3慢性ITP患者BAFF組INF-y濃度及TACI組培養(yǎng)上清IL-4、IL-6濃度較對(duì)照組明顯升高。3 活化的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞表面BAFF受體顯著上調(diào)3.1 在慢性ITP患者及健康對(duì)照體內(nèi),活化的血小板反應(yīng)性淋巴細(xì)胞表面BAFF-R及TACI表達(dá)較相應(yīng)的未活化細(xì)胞均顯著增高。3.2 慢性ITP患者活化的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞表面BAFF-R及TACI表達(dá)均顯著高于健康患者體內(nèi)相應(yīng)的淋巴細(xì)胞亞群。結(jié)論1 B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞是主動(dòng)免疫應(yīng)答過(guò)程中主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞。BAFF/BAFF-R信號(hào)通路通過(guò)上調(diào)Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡基因的表達(dá),抑制了B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的凋亡。同時(shí),B細(xì)胞的增殖在該信號(hào)通路作用下明顯增強(qiáng)。2 BAFF/TACI信號(hào)通路主要對(duì)CD4+和CD8+兩種T細(xì)胞亞群的生物學(xué)行起作用。TACI與BAFF結(jié)合后不僅增強(qiáng)了CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖,還促進(jìn)了兩種細(xì)胞亞群終末效應(yīng)型T細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及IL-4和IL-6的分泌。3 BAFF不受體間功能可能存在之間或間接的拮抗或協(xié)同作用。3.1 BAFF能有效促進(jìn)1型輔助性T細(xì)胞(T-helper typel, Thl)反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ的分泌,而這種活化作用是在多各受體的協(xié)同作用下完成的,任何一種受體單獨(dú)作用均不能有效傳遞該促進(jìn)作用。3.2 TACI能促進(jìn)2型輔助性T細(xì)胞(T-help type2,Th2)反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-6的分泌。但三種BAFF抗體共同作用時(shí)這種效應(yīng)被抑制。4 慢性ITP患者淋巴細(xì)胞的BAFF反應(yīng)性顯著增高4.1在ITP患者,BAFF-R不僅介導(dǎo)BAFF對(duì)B細(xì)胞凋亡的抑制作用,還促進(jìn)B細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞的增殖。TACI促進(jìn)ITP患者CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化以及IL-4、IL-6的分泌。而對(duì)于健康患者,BAFF僅通過(guò)BAFF-R的介導(dǎo)顯著降低B細(xì)胞的凋亡；對(duì)B細(xì)胞增殖以及T細(xì)胞的功能無(wú)顯著作用。這說(shuō)明慢性ITP患者淋巴細(xì)胞對(duì)BAFF的反應(yīng)性顯著高于健康人群。4.2 通過(guò)進(jìn)一步研究,我們發(fā)現(xiàn)ITP患者活化的GPIIb/IIIa反應(yīng)性淋巴細(xì)胞表面BAFF-R或TACI表達(dá)較健康對(duì)照體內(nèi)自身反應(yīng)性細(xì)胞顯著上調(diào)可能是導(dǎo)致ITP患者淋巴細(xì)胞BAFF反應(yīng)性增高的原因。意義我們的體外功能是要明確了各種BAFF受體在ITP血小板相關(guān)免疫反應(yīng)中對(duì)淋巴細(xì)胞生理活性的各個(gè)方面產(chǎn)生不同的影響,因此特異性地阻斷某一種BAFF受體的功能可以定向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)向預(yù)期方向進(jìn)行。因此,我們的實(shí)驗(yàn)為ITP的特異性免疫調(diào)節(jié)治療提供進(jìn)一步理論依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R558.2


本文編號(hào)：2318553