【摘要】：研究背景和目的動脈粥樣硬化是以動脈血管壁脂質(zhì)沉積、內(nèi)膜增生、炎性浸潤和粥樣斑塊形成為主要病理特征的病變,其引起的心腦血管疾病嚴重危害人類生命健康。在發(fā)達國家及多數(shù)發(fā)展中國家,動脈粥樣硬化發(fā)病率逐年升高,已成為人口死亡的主要原因之一,其發(fā)病機制非常復(fù)雜,受多種因素共同作用,國際學(xué)術(shù)界提出了多種動脈粥樣硬化發(fā)病機制學(xué)說,如炎癥學(xué)說、脂質(zhì)浸潤學(xué)說、血栓形成學(xué)說、氧化學(xué)說、損傷反應(yīng)學(xué)說、單克隆學(xué)說和免疫學(xué)說等。這些學(xué)說從不同角度對動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展進行了闡述,但都未能完全闡明動脈粥樣硬化的發(fā)病機制。盡管動脈粥樣硬化發(fā)病機制非常復(fù)雜,受多種因素共同作用,但慢性炎癥反應(yīng)始終是影響動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的一個重要原因。氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)是動脈粥樣硬化的重要危險因子,研究發(fā)現(xiàn)其具有促進動脈粥樣硬化泡沫細胞形成、損傷血管內(nèi)皮細胞、促進血管平滑肌細胞增殖遷移以及炎性細胞因子釋放等作用,參與并促進了動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。既往的研究證明,胰島素樣生長因子家族(IGFs)與炎癥有關(guān),對動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展起到了重要作用。IGF家族成員包括IGF配體IGF1和IGF2,細胞表面受體IGF-1R和IGF-2R,以及六種不同類型的結(jié)合蛋白IGFBPs。IGF1和IGF2與IGF-1R相互作用,都能作為在結(jié)構(gòu)與功能上與跨膜酪氨酸激酶相互作用的胰島素受體。IGF2還能與IGF-2R結(jié)合,其功能是通過細胞的內(nèi)吞作用和細胞內(nèi)降解配體來清除受體。IGF1是通過腦垂體分泌生長激素來控制,而IGF2似乎是由獨立的生長激素來控制。據(jù)證實,IGF1促進動脈粥樣硬化通過血管內(nèi)皮的部分調(diào)節(jié)功能。而IGF2與細胞的增殖、生長、遷移和分化有關(guān)。C反應(yīng)蛋白(CRP)是由炎癥或組織損傷產(chǎn)生的非特異性的急性時相反應(yīng)蛋白中最具有代表性的標(biāo)志物。CRP作為炎性反應(yīng)的敏感因子,已被證實是反映動脈粥樣硬化的敏感指標(biāo),CRP濃度的增加伴隨著心腦血管事件風(fēng)險的增加,是一個極有價值的預(yù)報因子。巨噬細胞大量攝取低密度脂蛋白(LDL),并將其氧化修飾成Ox-LDL是動脈粥樣硬化斑塊進展中的一個重要過程。CRP可以直接促進巨噬細胞攝取LDL并被氧化修飾成Ox-LDL,還可刺激巨噬細胞表達細胞因子及組織因子,同時對其他炎癥介質(zhì)的致粥樣硬化作用有放大作用。然而在THP-1巨噬細胞中,Ox-LDL、CRP和IGF2三者之間相互作用的關(guān)系尚不確定,Ox-LDL是否能影響CRP和IGF2的表達也不確定。本研究中,我們證明了Ox-LDL通過IGF2途徑上調(diào)THP-1巨噬細胞中CRP的表達。材料與方法1、細胞培養(yǎng)人單核THP-1細胞培養(yǎng)：10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,37℃、5%C02細胞培養(yǎng)箱。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。在每次實驗前用100nM佛波酯孵育THP-1細胞72h,誘導(dǎo)分化形成巨噬細胞,更換培養(yǎng)基后加50μg/mlOx-LDL孵育48h使其轉(zhuǎn)化成泡沫細胞。細胞接種在6孔板或12孔板中。2、Ox-LDL的準(zhǔn)備將LDL (200 mg protein/mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)溶液加入含硫酸銅(5 mM free Cu2+)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中進行氧化,37℃孵育24小時。加入含200mM的書二胺四乙酸(EDTA)的PBS溶液終止其氧化反應(yīng)。然后在37℃下透析48小時以去除Cu2+,最后通過0.45毫米的過濾器進行過濾滅菌。LDL的氧化性是通過硫代巴比妥反應(yīng)物(TBARS)與丙二醛雙(二甲基醇縮醛)(MDA)作為標(biāo)準(zhǔn)。該Ox-LDL中TBARS的含量與LDL中TBARS的含量比是6.0560.16:0.3260.15 nmol/100mg (p0.01)。新制備的Ox-LDL保存在50 mM Tris-HCl,0.15 M NaCl and 2.0 mM EDTA中,其保存的pH為7.4,并在使用前十天之內(nèi)準(zhǔn)備。3、實時熒光定量PCR按照TRIzol試劑盒(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)的說明書提取THP-1巨噬細胞的總RNA,將1μg總RNA用反轉(zhuǎn)錄成20μl cDNA。以7500系統(tǒng)的實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)檢測細胞中mRNA含量,以GAPDH的表達量為內(nèi)參并以△△Ct方法定量mRNA表達量。本實驗采用以下的引物序列IGF2正向,5'-GGAACCCACATTGG CCTGA-3'; IGF2反向,5'-CCGGCGAGGCAGAATATAACAC-3'; CRP正向,5'-AATGTGAACATGTGGGACTTTGTG-3'; CRP反向,5'-CGCCAGTTCAGGA CAT TAGG AC-3'.4、免疫印跡分析用放射免疫沉淀測定緩沖液(Biocolor Ltd., Belfast, Northern Ireland, UK)提取THP-1巨噬細胞中的蛋白,采用BCA量化蛋白測定試劑盒(凱基生物,南京,中國)對蛋白的濃度進行測定。接著向蛋白提取物中加入1/4體積的5(X) SDS,混勻并煮沸10min,冷卻置冰箱待用。然后進行Western blotting分析,10%瓊脂糖凝膠電泳分離目的蛋白,按流程依次電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后以兔多克隆抗CRP (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)和兔多克隆抗IGF2 (Abcam, Cambridge, MA, USA)一抗孵育過夜,以兔多克隆抗β-actin (Abcam)抗體為內(nèi)參,洗滌孵育二抗再洗滌后,以化學(xué)發(fā)光法顯示條帶,檢測目的蛋白的表達。5、siRNAs轉(zhuǎn)染人類IGF2特異性siRNA(IGF2-siRNA)和對照siRNA合成來自銳博生物科技公司(Cambridgeshire, UK)。采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染細胞(2×106/well)。轉(zhuǎn)染后48小時采用Western blotting分析檢測干擾效果。6重組質(zhì)粒的構(gòu)建重組質(zhì)粒從Invitrogen Corporation購買,并通過測序驗證,命名為pcDNA3.1-IGF2。采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染細胞(2×106/well)。轉(zhuǎn)染后48小時采用Western blotting分析檢測干擾效果。7、統(tǒng)計處理每組實驗重復(fù)3次,采用SPSS 13.0軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)進行數(shù)據(jù)分析,計量數(shù)據(jù)以x±s表示(SDs)。各基因mRNA的相對表達量、各蛋白Western blotting分析條帶的相對灰度值比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1、Ox-LDL上調(diào)THP-1巨噬細胞中IGF2的表達為了研究在巨噬細胞形成泡沫細胞過程中,mRNA表達量可能發(fā)生的變化,我們以THP-1巨噬細胞為對照組,以THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞為處理組進行了基因芯片分析。芯片結(jié)果表明,IGF1,IGF2,和CRP基因表達水平分別增加了219,620,和326%。但沒有顯著的改變IGF-1R,IGF-2R和六種不同類型結(jié)合蛋白IGFBPs的基因表達水平。已有研究證明IGF1能促進炎癥細胞因子的表達,而CRP被證明是由炎癥或組織損傷產(chǎn)生的非特異的急性時相反應(yīng)中最具有代表性的標(biāo)志物。因此,我們的目的是探討在THP-1巨噬細胞中,Ox-LDL能否通過IGF2途徑上調(diào)CRP的表達。為了達到這個目的,我們通過實時定量PCR和Western blotting來驗證THP-1巨噬細胞中Ox-LDL對IGF2表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在THP-1巨噬細胞中,不管是實時定量PCR,還是Western blotting分析,Ox-LDL都能在時間和濃度梯度上明顯上調(diào)IGF2的mRNA和蛋白水平。2、Ox-LDL上調(diào)THP-1巨噬細胞中CRP的表達眾所周知,炎癥反應(yīng)與血管損傷之間有著密切的聯(lián)系,并且血管修復(fù)在動脈粥樣硬化發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用。CRP不僅是動脈粥樣硬化的重要標(biāo)志物,而且也能作為一種調(diào)節(jié)器,參與動脈粥樣硬化斑塊的形成。而現(xiàn)有的研究證明Ox-LDL在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。芯片結(jié)果顯示,在THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞中,CRP的表達水平明顯高于在THP-1巨噬細胞。因此,我們探討在THP-1巨噬細胞中,Ox-LDL對CRP表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在THP-1巨噬細胞中,不管是實時定量PCR,還是Western blotting分析,Ox-LDL都能在時間和濃度梯度上明顯上調(diào)CRP的mRNA和蛋白水平。3、IGF2介導(dǎo)了Ox-LDL上調(diào)THP-1巨噬細胞中CRP的表達以往的研究表明,IGF家族在炎癥反應(yīng)中起到了重要的調(diào)節(jié)作用。因此,我們推測在THP-1巨噬細胞中,Ox-LDL通過IGF2途徑上調(diào)CRP的表達。在THP-1巨噬細胞中用重組質(zhì)粒過表達IGF2 (pcDNA3.1-IGF2), IGF2蛋白質(zhì)的表達水平增加到896%,此外,CRP蛋白的表達量也顯著增加。并且重組質(zhì)粒過表達IGF2可加深Ox-LDL上調(diào)CRP蛋白的表達水平。接下來,我們研究了IGF2特異性siRNA處理THP-1巨噬細胞對Ox-LDL誘導(dǎo)CRP蛋白表達上調(diào)的影響。我們發(fā)現(xiàn)在THP-1巨噬細胞中siRNA處理IGF2, IGF2蛋白的表達量下調(diào)了90%,此外,CRP蛋白的表達量也明顯下調(diào)。而siRNA-IGF2減弱了Ox-LDL上調(diào)CRP蛋白表達的能力。結(jié)論1、發(fā)現(xiàn)在THP-1巨噬細胞中,Ox-LDL在時間和濃度梯度上明顯上調(diào)IGF2和CRP的mRNA和蛋白水平。2、發(fā)現(xiàn)在THP-1巨噬細胞中,用重組質(zhì)粒過表達IGF2可加深Ox-LDL上調(diào)CRP蛋白的表達,而用siRNA干擾IGF2的表達會減弱Ox-LDL上調(diào)CRP蛋白的表達。說明Ox-LDL通過IGF2途徑上調(diào)THP-1巨噬細胞中CRP的表達。為動脈粥樣硬化的發(fā)生機制進行了進一步的闡述。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 阮秋蓉;;干細胞/組細胞與動脈粥樣硬化研究進展[J];中國動脈硬化雜志;2011年05期

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本文編號：2310060