發(fā)布時間：2018-10-24 12:36

【摘要】：第一部分轉(zhuǎn)錄相關(guān)增強子-1對過氧化氫誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞衰老的影響 目的：以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)作為研究對象,觀察轉(zhuǎn)錄相關(guān)增強子-1(RTEF-1)對過氧化氫誘導(dǎo)的HUVECs衰老的影響。 方法：將pXJ40/RTEF-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HUVECs中,再用500μg/mLG418篩出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞。將人工設(shè)計并合成的陰性對照(negative control siRNA)序列和RTEF-1siRNA1,2序列分別瞬時轉(zhuǎn)染HUVECs。采用RT-PCR和western blot檢測轉(zhuǎn)染細胞中RTEF-1過表達效率和RTEF-1siRNA對該基因的抑制效率。 體外用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)HUVECs,以1×106個細胞每孔種板,再將細胞隨機分為7組：(1)對照組；(2)H2O2組：給予含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h；(3)陰性對照組：給予穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的HUVECs含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h;(4) RTEF-1過表達組：給予穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RTEF-1過表達的HUVECs含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h；(5)negative control siRNA組：用negative control siRNA轉(zhuǎn)染細胞6h,再給予含100μmol/LH202的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h；(6)RTEF-1siRNA1組：用RTEF-1siRNA1轉(zhuǎn)染細胞6h,再給予含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h；(7)RTEF-1siRNA2組：用RTEF-1siRNA2轉(zhuǎn)染細胞6h,再給予含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h。使用衰老相關(guān)p-半乳糖苷酶染色進行衰老細胞計數(shù),流式細胞分析細胞周期。并用RT-PCR和Western-blot檢測RTEF-1mRNA和蛋白表達。 結(jié)果：與陰性對照組相比,RTEF-1過表達組HUVECs的RTEF-1mRNA和蛋白表達明顯升高。與陰性siRNA對照組相比,RTEF-1siRNA1和2轉(zhuǎn)染HUVECs后可抑制RTEF-1表達,作為后續(xù)實驗所需的siRNAs干預(yù)組(p0.05)。與對照組比較,H202刺激組p-半乳糖苷酶染色陽性細胞比例增加,細胞衰老明顯,并且流式分析細胞周期顯示H202刺激組停滯在G0/G1期細胞比例增加,而S期細胞比例減少。這些提示H202誘導(dǎo)了HUVECs衰老。與陰性對照組相比,RTEF-1過表達組p-半乳糖苷酶染色陽性細胞比例減少,細胞周期分析中停滯在G0/G1期細胞比例減少。與此相反,RTEF-1siRNA1,2組p-半乳糖苷酶染色陽性細胞比例增加,細胞周期分析中停滯在G0/G1期細胞比例也增加。 結(jié)論：給予含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育HUVECs48h,可致血管內(nèi)皮細胞衰老。過表達RTEF-1減少了H202誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞衰老,而RTEF-1siRNA增加了H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞衰老,說明RTEF-1具有保護H202誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞衰老的作用。 第二部分轉(zhuǎn)錄相關(guān)增強因-1在過氧化氫誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞衰老中對細胞周期關(guān)鍵基因的調(diào)控作用 目的：以人臍靜脈內(nèi)皮細胞為研究對象,探討RTEF-1在H2O2誘導(dǎo)HUVECs衰老過程中,對調(diào)節(jié)細胞周期的關(guān)鍵基因p53和p21的調(diào)控作用。 方法：HUVECs隨機分為5組：(1)陰性對照組：給予穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的HUVECs含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h；(2)RTEF-1過表達組：給予穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RTEF-1過表達的HUVECs含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h；(3)negative control siRNA組：用negative control siRNA轉(zhuǎn)染細胞6h,再給予含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h;(4)RTEF-1siRNA1組：用RTEF-1siRNA1轉(zhuǎn)染細胞6h,再給予含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h；(5)RTEF-1siRNA2組：用RTEF-1siRNA2轉(zhuǎn)染細胞6h,再給予含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h。RT-PCR和Western-blot分別檢測p53和p21mRNA和蛋白表達。 結(jié)果：與陰性對照組相比,RTEF-1過表達組細胞p53和p21mRNA和蛋白表達明顯減少。而與陰性siRNA對照組相比,RTEF-1siRNA1和2轉(zhuǎn)染HUVECs后增加了p53和p21mRNA和蛋白表達。 結(jié)論：RTEF-1可以減少H202作用后細胞內(nèi)p53和p21表達,而p53和p21表達的改變可能是RTEF-1減少H202作用后G0/G1期細胞比例的一個原因。這進一步說明RTEF-1參與了血管內(nèi)皮細胞抗衰老過程。 第三部分Klotho激活在轉(zhuǎn)錄相關(guān)增強子-1抗衰老過程中的作用 目的：以人臍靜脈內(nèi)皮細胞為研究對象,探討Klotho基因是否參與了RTEF-1抗衰老的過程。 方法：將人工設(shè)計并合成的陰性對照(negative control siRNA)序列和Klotho siRNA1,2序列分別轉(zhuǎn)染入空白對照HUVECs和RTEF-1過表達HUVECs中。分別使用RT-PCR和western blot檢測Klotho siRNA對該基因的抑制效率。 HUVECs隨機分為11組：(1)陰性對照組：給予穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的HUVECs含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h；(2)RTEF-1過表達組：給予穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RTEF-1過表達的HUVECs含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h；(3)negative control siRNA組：用negative control siRNA轉(zhuǎn)染細胞6h,再給予含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h;(4)RTEF-1siRNA1組：用RTEF-1siRNA1轉(zhuǎn)染細胞6h,再給予含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h；(5)RTEF-1siRNA2組：用RTEF-1siRNA2轉(zhuǎn)染細胞6h,再給予含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h。(6)negative control siRNA轉(zhuǎn)染control HUVECs組：用negative control siRNA轉(zhuǎn)染control:細胞6h,再給予含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h;(7) Klotho siRNA1轉(zhuǎn)染control HUVECs組：用Klotho siRNA1轉(zhuǎn)染control細胞6h,再給予含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h;(8)Klotho siRNA2轉(zhuǎn)染control HUVECs組：用Klotho siRNA2轉(zhuǎn)染control-細胞6h,再給予含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h；(9)negative control siRNA轉(zhuǎn)染RTEF-1過表達HUVECs組：用negative control siRNA轉(zhuǎn)染RTEF-1過表達細胞6h,再給予含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h;(10) Klotho siRNA1轉(zhuǎn)染RTEF-1過表達HUVECs組：用Klotho siRNAl轉(zhuǎn)染RTEF-1過表達細胞6h,再給予含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h；(11)Klotho siRNA2轉(zhuǎn)染RTEF-1過表達HUVECs組：用Klotho siRNA2轉(zhuǎn)染RTEF-1過表達細胞6h,再給予含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基預(yù)孵育48h。使用衰老相關(guān)p-半乳糖苷酶染色進行衰老細胞計數(shù)和流式細胞分析細胞周期,并用雙熒光素酶試劑盒檢測Klotho啟動子活性。RT-PCR和Western-blot檢測Klotho, p53和p21mRNA和蛋白表達。 結(jié)果：與陰性對照組相比,RTEF-1過表達組Klotho mRNA和蛋白表達明顯增加,而RTEF-1siRNAl和2轉(zhuǎn)染HUVECs后Klotho mRNA和蛋白表達減少。而且RTEF-1可呈濃度依賴性地激活Klotho啟動子活性。Klotho siRNA同時增加了轉(zhuǎn)染control HUVECs及RTEF-1過表達]HUVECs組中β-半乳糖苷酶染色陽性細胞比例和G0/G1期細胞比例。另外,Klotho siRNA上調(diào)了轉(zhuǎn)染control HUVECs組的p53和p21mRNA和蛋白表達,但是對RTEF-1過表達組影響不大。 結(jié)論：RTEF-1可以上調(diào)Klotho表達及激活其啟動子活性。Klotho siRNA可以阻斷RTEF-1保護H202誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞衰老的效應(yīng),并且上調(diào)了p53和p21表達。進一步說明了RTEF-1是一個抗衰老的基因,并且是通過調(diào)控Klotho發(fā)揮作用。 第一部分肺炎衣原體感染對人臍靜脈內(nèi)皮細胞脂質(zhì)代謝的影響 目的：本實驗以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)為研究對象,體外研究肺炎衣原體(C.pn)感染對HUVECs脂質(zhì)代謝的影響。 方法：體外增殖培養(yǎng)C.pn。體外用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs,以1×106個細胞每孔種板,再將細胞隨機分為3組：(1)陰性對照組：給予含50mg/L低密度脂蛋白(LDL)的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h；(2)C.pn感染組：在負荷50mg/L LDL的條件下,給予1×106IFU C.pn感染48h；(3)陽性對照組：給予含50mg/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。顯微鏡下觀察鑒定C.pn有無感染HUVECs.運用硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(TBARS)方法檢測脂質(zhì)過氧化量。運用酶比色法檢測細胞內(nèi)總膽固醇(TC)及膽固醇酯(CE)含量改變。 結(jié)果：與陰性對照組比較,C.pn感染的HUVECs的上清,而不是細胞裂解物使LDL氧化(p0.05)。此外,與陰性對照組比較,C.pn感染增加負荷LDL的HUVECs的TC和CE含量(p0.05)。而與陽性對照組比較,TC和CE含量差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 結(jié)論：在負荷LDL的條件下,C.pn感染48h后,可誘導(dǎo)HUVECs的LDL氧化及紊亂脂質(zhì)代謝。 第二部分肺炎衣原體感染對參與人臍靜脈內(nèi)皮細胞脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因表達的影響 目的：本實驗以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)為研究對象,觀察參與細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因：清道夫受體A(SR-A1)、B (CD36)、�；o酶A：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶1(ACAT1)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ABCA1)和G1(ABCG1)在肺炎衣原體擾亂內(nèi)皮細脂質(zhì)代謝中的作用。 方法：HUVECs隨機分為3組：(1)陰性對照組：給予含50mg/L低密度脂蛋白(LDL)的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h；(2)C.pn感染組：在負荷50mg/L LDL的條件下,給予1×106IFU C.pn感染48h；(3)陽性對照組：給予含50mg/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。分別運用RT-PCR和Western-blot方法檢測各組SR-A1、 CD36、ACAT1、ABCA1和ABCG1mRNA和蛋白表達。 結(jié)果：與陰性對照組相比,C.pn感染HUVECs能上調(diào)SR-A1、CD36和ACAT1mRNA和蛋白表達,并且下調(diào)ABCA1和ABCG1mRNA和蛋白表達(所有p0.05)。與陽性對照組相比,SR-A1、CD36、ACAT、ABCA1和ABCG1mRNA和蛋白表達差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 結(jié)論：C.pn感染負荷LDL的HUVECs后,增加SR-A1、CD36和ACAT1表達,抑制ABCA1和ABCG1表達,從而破壞內(nèi)皮細胞脂質(zhì)代謝的穩(wěn)態(tài),進而可能致內(nèi)皮功能受損。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R54

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本文編號：2291440