【摘要】：研究背景隨著人口老齡化及城鎮(zhèn)化進(jìn)程的加速,我國心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVD)患病率及死亡率仍處于上升階段。目前,CVD死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位,在農(nóng)村為44.8%,城市為41.9%,已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類健康[1]。預(yù)測截止2030年,我國CVD患者將增加2130萬,因此疾病而死亡的患者將增加770萬[2]。因此,CVD已逐漸成為人們所面臨的重要健康問題,了解各種CVD疾病的發(fā)病機(jī)制并針對相應(yīng)靶點進(jìn)行對應(yīng)預(yù)防和治療已刻不容緩。心力衰竭是目前CVD中最常見,對患者危害最大的疾病,許多CVD患者最終死于該疾病。隨著對該疾病研究的不斷深入,越來越多證據(jù)表明心力衰竭發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)是心肌肥大[3]。因此對心肌肥大過程中心肌細(xì)胞接受相應(yīng)刺激后下游一系列胞內(nèi)的確切機(jī)制的研究越來越引發(fā)人們的關(guān)注。尾加壓素II(Urotensin II,UII)是一種生長抑素樣環(huán)肽,最早是在硬骨魚的脊髓尾部神經(jīng)分泌系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)并分離出來,人體內(nèi)UII(h UII)也于1998年被克隆出來[4]。UII及其受體分布十分廣泛,人體內(nèi)多種組織中都可發(fā)現(xiàn)其表達(dá),尤以心血管系統(tǒng)內(nèi)分布最多。UII是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的縮血管物質(zhì),但其作用并不僅限于此,在不同種屬、身體不同部位對血管的作用也千差萬別。還有研究表明,UII也可調(diào)節(jié)心功能。有實驗表明,在離體實驗中,UII對人的心房和心室表現(xiàn)出正性肌力作用,其對于右心房肌小梁收縮的促進(jìn)作用呈劑量依賴性[5]。Douglas等提出,與早期充血性心力衰竭患者相比,h UII及其受體的m RNA在慢性心力衰竭終末期患者心肌細(xì)胞中表達(dá)明顯增加[6]。Lapp等發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)血漿h UII明顯升高與心功能損害正相關(guān)[7]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)UII呈濃度依賴性的抑制大鼠心功能。因此,對UII誘導(dǎo)心肌肥大通路機(jī)制的研究可為預(yù)防治療該疾病提供新的思路。另有研究提示,心肌細(xì)胞的肥大過程涉及多條信號通路,比如G蛋白、小G蛋白、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C、TGF-β等,但UII對于誘導(dǎo)心肌肥大是否同樣依賴于這些通路尚未可知。本實驗前期研究結(jié)果表明,PKA信號通路在UII誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在Langendorff離體大鼠心臟模型上,PKA的特異性抑制劑KT-5720可以阻斷UII作用于心力衰竭大鼠心臟功能的作用,由此可推斷出UII可能通過PKA途徑對大鼠心臟功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。那么,UII在致心肌肥大過程中,PKA信號通路是否參與了這一過程,如若參與,可能涉及的細(xì)胞分子機(jī)制是什么?近期有文獻(xiàn)報道,UII致心肌肥大效應(yīng)與心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+及其相關(guān)通路活化有關(guān),心肌細(xì)胞的肌漿網(wǎng)可通過調(diào)節(jié)多種鈣調(diào)蛋白保持Ca2+進(jìn)出胞漿處于動態(tài)平衡狀態(tài),從而使其濃度保持在一定范圍內(nèi),進(jìn)而調(diào)控心肌細(xì)胞的收縮和舒張功能。本實驗前期研究結(jié)果也表明UII可能通過PKA途徑抑制心室肌細(xì)胞L-型鈣電流而發(fā)揮心功能抑制作用,故本課題推測UII致心肌細(xì)胞肥大作用可能與PKA信號通路及下游鈣相關(guān)調(diào)控蛋白對胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)有關(guān)。本實驗計劃分三個部分進(jìn)行。首先,在腹主動脈縮窄術(shù)所導(dǎo)致的心衰模型上,觀察模型大鼠心功能情況及心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,檢測胞內(nèi)UII及鈣相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。其次,在離體培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞上,給予不同濃度UII處理,在不同時間點進(jìn)行相應(yīng)的分析檢測,觀察胞內(nèi)UII、Ca2+及相關(guān)蛋白的表達(dá)變化是否受到UII濃度和處理時間的影響。最后,在離體培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞中加入PKA的特異性抑制劑KT-5720,觀察PKA信號通路被阻斷后UII對心肌細(xì)胞肥大作用的誘導(dǎo)是否會改善。本實驗擬探明UII對心肌肥大誘導(dǎo)作用的機(jī)制是否與PKA信號通路及下游各種鈣調(diào)蛋白相關(guān),為今后心肌肥大乃至心力衰竭疾病的預(yù)防和治療的過程提供新的干預(yù)靶點。第一部分UⅡ在慢性壓力超負(fù)荷大鼠心肌組織中表達(dá)的變化目的:觀察慢性壓力超負(fù)荷大鼠的心功能情況,心肌組織形態(tài)學(xué)以及UII、PKA及相關(guān)蛋白表達(dá)情況。方法:采用腹主動脈縮窄術(shù)建立慢性壓力超負(fù)荷大鼠模型,隨機(jī)選取32只為假手術(shù)組,其余40只制作腹主動脈縮窄模型,于造模后2w、4w、8w、12w動態(tài)觀測各項指標(biāo):⑴超聲心動圖對心功能進(jìn)行整體評價;⑵右頸總動脈插管行血流動力學(xué)檢測;⑶HE染色觀察心肌組織形態(tài)變化,進(jìn)而推斷病理改變;⑷免疫組化學(xué)法觀察UⅡ、RYR2、PKA、p-PKA、ser16p-PLN、PLN、SERCA2a在心肌組織中表達(dá)的變化。結(jié)果:(1)超聲心動圖結(jié)果顯示模型組動物室間隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWTd)左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)于術(shù)后均明顯增厚,至術(shù)后12w時,厚度增加極顯著,心室腔擴(kuò)大。(2)血流動力學(xué)結(jié)果顯示,隨著造模時間的增加,造模后左心室舒張末壓(LVEDP)增加,左心室收縮壓(LVSP)、左心室壓力上升/下降最大速率(+dp/dtmax、-dp/dtmax)逐漸降低,造模8w后差異極其顯著。(3)HE染色結(jié)果顯示模型組動物心肌細(xì)胞肥大,心肌纖維增生,心肌細(xì)胞排列紊亂,尤以8w、12w顯示最為明顯。(4)免疫組化結(jié)果顯示模型組UII、Ry R2、p-PKA、p-PLN、SERCA2a等蛋白的表達(dá)量顯著增加并表現(xiàn)出時間依賴性。結(jié)論:(1)通過腹主動脈縮窄術(shù)建立慢性壓力超負(fù)荷心力衰竭大鼠模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)心室腔增大,心肌出現(xiàn)肥大,心肌纖維化增生,且呈時間依賴性。(2)UⅡ、RYR2、p-PKA、ser16p-PLN、SERCA2a在心肌組織中的表達(dá)呈時間依賴性增加。(3)PKA信號通路可能在UII促進(jìn)心力衰竭發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。第二部分UrotensinⅡ在誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大過程中的作用目的:進(jìn)一步探討不同濃度UII在不同作用時間下對離體培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞的作用。方法:對乳鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行分離和培養(yǎng),將原代心肌細(xì)胞隨機(jī)分組:⑴正常對照組;(2)UⅡ組(U II濃度分別是10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L),每種濃度的UII分別在不同的作用時間點進(jìn)行檢測(12h、24h、48h)。采用MTT法檢測心肌細(xì)胞的活力情況,應(yīng)用倒置相差顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞生長狀態(tài),采用圖像分析軟件測量心肌細(xì)胞的截面面積,BCA法檢測心肌細(xì)胞胞內(nèi)蛋白質(zhì)總量,Hoechst33258染色檢測心肌細(xì)胞胞內(nèi)DNA的總量以及相應(yīng)蛋白質(zhì)/DNA的比值,Fura-3AM熒光染色用于檢測心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣離子濃度變化,Western blot方法檢測離體培養(yǎng)心肌細(xì)胞胞內(nèi)ANP、p-PKA、PKA、Ry R2、p-PLN、PLN、SERCA2a蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果:(1)MTT實驗結(jié)果顯示,在相同處理時間下,從無UII到10-6mol/L濃度下,活的心肌細(xì)胞數(shù)量有隨UII濃度增加而呈顯著增加的趨勢。UII處理時間延長,細(xì)胞活性也隨時間依賴性增強(qiáng)。(2)離體培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞截面面積、蛋白質(zhì)總量有顯著增加的趨勢(p0.05),而DNA總量無顯著變化,相應(yīng)蛋白質(zhì)/DNA的比值也顯著升高(p0.05)。(3)隨著UII處理濃度的增加(從0-10-6mol/L),心肌細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度呈顯著上升趨勢。(4)與對照組相比,UII處理組的心肌細(xì)胞中ANP、p-PKA、Ry R2、p-PLN、SERCA2a等蛋白的表達(dá)量均呈劑量依賴性的升高,且在10-9mol/L的處理濃度下即表現(xiàn)出與對照組顯著的差異(p0.05)。結(jié)論:(1)UII可增強(qiáng)心肌細(xì)胞的活性,并可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。(2)UII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大作用可能有PKA信號通路的參與。第三部分PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在UⅡ促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大過程中的作用及其機(jī)制研究目的:探討PKA信號通路參與UII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大作用及其機(jī)制。方法:乳鼠心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng),采用原代心肌細(xì)胞隨機(jī)分組:⑴對照組;⑵UⅡ組:UⅡ10-8mol/L;⑶UⅡ+KT-5720組:UⅡ10-8mol/L+KT-5720;(4)KT-5720組。于倒置熒光顯微鏡下拍照,并用相應(yīng)軟件測量心肌細(xì)胞的截面面積,檢測心肌細(xì)胞胞內(nèi)蛋白質(zhì)總量(BCA法),Hoechst33258染色檢測心肌細(xì)胞胞內(nèi)DNA的總量,計算相應(yīng)蛋白質(zhì)/DNA的比值,Fura-3AM熒光染色用于探測心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣離子濃度變化,Western blot方法檢測離體培養(yǎng)心肌細(xì)胞p-PKA、PKA、p-PLN、PLN、SERCA2a的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果:(1)10-8mol/L濃度的UⅡ處理可誘導(dǎo)心肌肥大,而KT-5720預(yù)處理則可抑制心肌細(xì)胞的肥大。(2)UII可導(dǎo)致肥大心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高,KT-5720預(yù)處理可減弱鈣濃度的升高。(3)KT-5720的預(yù)處理可使UII誘導(dǎo)的p-PKA、p-PLN、SERCA2a等蛋白的升高顯著降低。結(jié)論:PKA信號通路參與了UII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R542.2

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本文編號：2289542