【摘要】：動(dòng)脈粥樣硬化是血管壁的慢性炎癥性病變,大量的研究表明TNF-α作為多功能的炎癥細(xì)胞因子,可以導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的功能和形態(tài)發(fā)生改變,是動(dòng)脈粥樣硬化病變過(guò)程中的重要因子,另有研究指出神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子Slit2蛋白具有抗炎作用。因此本研究用TNF-α刺激體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),以模擬內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng),以Slit2蛋白作為抗炎因子,觀察炎癥介質(zhì)IL-8、ICAM-1、VCAM-1表達(dá)的變化,以探討Slit2蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路在抑制TNF-α介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的可能機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)共分為以下三個(gè)部分:第一部分:Slit2及其受體Robo1、Robo4在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)目的:檢測(cè)Slit2、Robo1、Robo4基因及蛋白在HUVECs上的表達(dá)。方法:用Semi-quantitative RT PCR(RT-PCR)及Western Blot技術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Slit2、Robo1、Robo4基因及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Slit2、Robo1、Robo4基因及蛋白。結(jié)論:人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Slit2、Robo1、Robo4。第二部分:Slit2蛋白對(duì)TNF-α介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)IL-8、ICAM-1、VCAM-1表達(dá)的影響目的:探討Slit2蛋白對(duì)TNF-α介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響。方法:1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分為正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。正常對(duì)照組(NC組):培養(yǎng)基中不加TNF-α。陽(yáng)性對(duì)照組(TNF-α組):培養(yǎng)基中TNF-α的濃度分別為1μg/L、10μg/L、100μg/L。實(shí)驗(yàn)組(TNF-α+Slit2組):培養(yǎng)基中分別含10μg/L的TNF-α和不同濃度梯度的Slit2蛋白(25、50、100、200μg/L),各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后用real-time PCR和Eliasa技術(shù)檢測(cè)IL-8基因及蛋白的表達(dá)。2.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分為正常對(duì)照組(NC組):培養(yǎng)基中不含TNF-α和Slit2;陽(yáng)性對(duì)照組(TNF-α組):培養(yǎng)基中TNF-α的終濃度為10μg/L;實(shí)驗(yàn)組(TNF-α+Slit2組):培養(yǎng)基中含有10μg/L的TNF-α和100μg/L的Slit2,分別將各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后,采用real-time PCR及Western Blot方法檢測(cè)ICAM-1、VCAM-1基因及蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.與NC組比較,10μg/L的TNF-α可上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞IL-8m RNA的表達(dá),并促進(jìn)IL-8的分泌(P(27)01.0)。2.Slit2蛋白的濃度為50μg/L、100μg/L、200μg/L時(shí)可以抑制TNF-α介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞IL-8的基因及蛋白的表達(dá)(P(27)05.0),并且Slit2蛋白的濃度為100μg/L時(shí)抑制作用更明顯(P(27)01.0)。3.100μg/L Slit2可抑制TNF-α介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1、ICAM-1基因及蛋白的表達(dá)(P(27)01.0)。結(jié)論:1.Slit2可以抑制TNF-α介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)IL-8的分泌;2.Slit2對(duì)TNF-α引起的內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1的上調(diào)具有抑制作用。第三部分:Slit2蛋白及其受體Robo抑制TNF-α介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制探討目的:1.探討Slit2蛋白在抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的受體是Robo1或Robo4 2.初步探討Slit2蛋白抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制。方法:1.利用si RNA技術(shù)沉默內(nèi)皮細(xì)胞Robo1或Robo4蛋白的表達(dá)。針對(duì)Robo1、Robo4基因序列的三個(gè)不同位點(diǎn),設(shè)計(jì)三段不同的si RNA序列,分別命名為Robo1-si RNA-1、Robo1-si RNA-2、Robo1-si RNA-3,Robo4-si RNA-1、Robo4-si RNA-2、Robo4-si RNA-3。細(xì)胞分為以下三組:正常對(duì)照組(NC組);陰性對(duì)照組(NT-si RNA組);實(shí)驗(yàn)組:細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Robo1-si RNA和Robo4-si RNA。將各組細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后,利用real-time及Western Blot檢測(cè)Robo1、Robo4基因和蛋白的表達(dá),篩選最佳轉(zhuǎn)染位點(diǎn)。2.轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分為以下三組:(1)轉(zhuǎn)染NT-si RNA組:(1)陰性對(duì)照組:培養(yǎng)基中不含TNF-α和Slit2;(2)TNF-α組:培養(yǎng)基中含10μg/L的TNF-α;(3)TNF-α+Slit2組:培養(yǎng)基中含10μg/L的TNF-α和100μg/L的Slit2;(2)轉(zhuǎn)染Robo1-si RNA組:培養(yǎng)基中含10μg/L的TNF-α和100μg/L的Slit2;(3)轉(zhuǎn)染Robo4-si RNA:培養(yǎng)基中含10μg/L的TNF-α和100μg/L的Slit2。分別將各組細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后,用real-time PCR及Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞細(xì)胞炎癥介質(zhì)ICAM-1及VCAM-1的表達(dá),3.將細(xì)胞分為正常對(duì)照組:培養(yǎng)基中不含TNF-α和Slit2;陽(yáng)性對(duì)照組(TNF-α組):培養(yǎng)基中含10μg/L的TNF-α;實(shí)驗(yàn)組(TNF-α+Slit2組):培養(yǎng)基中含10μg/L的TNF-α和100μg/L的Slit2,分別在加入Slit2蛋白后的1h、2h、4h提取各組細(xì)胞蛋白,利用Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)IKBa、p-IKBa、NF-k B、p-NF-k B的表達(dá)變化。結(jié)果:1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染Robo1-si RNA-1或Robo4-si RNA-1后分別可以沉默Robo1或Robo4蛋白的表達(dá)。2.TNF-α+Slit2+NT-si RNA組與TNFα+NT-si RNA組比較,Slit2可以抑制ICAM-1、VCAM-1基因及蛋白的表達(dá)(P(27)05.0)。3.TNF-α+NT-si RNA組與轉(zhuǎn)染Robo1組比較ICAM-1、VCAM-1基因及蛋白的表達(dá)降低(P(27)05.0),與轉(zhuǎn)染Robo4組比較,ICAM-1及VCAM-1基因及蛋白的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P(29)05.0)。4.轉(zhuǎn)染Robo1組與轉(zhuǎn)染Robo4組比較,后者的ICAM-1及VCAM-1基因及蛋白表達(dá)量增高(P(27)05.0),5.各組細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)后,TNF-α+slit2組與TNF-α組比較,TNF-α+slit2組p-IKBa及p-NF-k B表達(dá)量明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(27)05.0)。各組細(xì)胞培養(yǎng)1h和4h時(shí),TNF-α組與TNF-α+Slit2組比較,IKBa、p-IKBa、NF-k B、p-NF-k B蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(29)05.0)。結(jié)論:1.Slit2蛋白與受體Robo4結(jié)合,抑制TNF-α引起的炎癥介質(zhì)ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)上調(diào)。2.Slit2-Robo4信號(hào)通路可減少炎癥反應(yīng)中IKBa和NF-k B的磷酸化,從而抑制TNF-α在炎癥中的作用。
[Abstract]:The expression of Slit2 , Robo1 , Robo4 and protein in cultured human umbilical vein endothelial cells were investigated by means of semi - quantitative RT - PCR and Western Blot . The expression of ICAM - 1 , VCAM - 1 and protein in human umbilical vein endothelial cells induced by TNF - 偽 were investigated by real - time PCR and Western Blot . The expression of ICAM - 1 and VCAM - 1 and the expression of ICAM - 1 and VCAM - 1 in the culture medium were detected by real - time PCR and Western Blot . 1 . Slit2 protein binds to receptor Robo4 to inhibit the expression of ICAM - 1 and VCAM - 1 in inflammatory mediators induced by TNF - 偽 . The Slit2 - Robo4 signaling pathway can reduce the phosphorylation of IKBa and NF - k B in inflammatory reaction , thereby inhibiting the role of TNF - 偽 in inflammation .
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2122995