本文選題：心臟干細(xì)胞 + 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞��； 參考：《蘇州大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：背景:干細(xì)胞移植治療心肌梗死(myocardial infarction,MI)已成為全球一大熱點(diǎn)。干細(xì)胞能夠促進(jìn)血管發(fā)生、恢復(fù)血供,再生梗死的心肌組織,促使心臟結(jié)構(gòu)和功能性恢復(fù)。目前研究報(bào)道,可供選擇的種子細(xì)胞包括間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)、胚胎干細(xì)胞(ESCs)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(i PS)、內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)、心臟干細(xì)胞(CSCs)等。其中,CSCs因更易向心肌系細(xì)胞分化,在治療MI方面被認(rèn)為具有巨大潛力。經(jīng)過(guò)多年的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)研究,現(xiàn)已證實(shí)CSCs能夠促進(jìn)受損心肌的修復(fù)。然而,CSCs移植治療MI仍存在著一些困擾,即干細(xì)胞存活定植、分化能力欠佳。因此,為了增強(qiáng)CSCs的修復(fù)心肌的能力,目前報(bào)道的方法有多種,主要包括基因修飾、組蛋白修飾、缺氧預(yù)處理等�，F(xiàn)已證實(shí)BMSCs-Exosomes具有促進(jìn)MI區(qū)域血管發(fā)生、降低心梗面積的能力。另外,有研究報(bào)道乳腺癌細(xì)胞經(jīng)BMSCs-Exosomes刺激后,其遷移/侵襲能力明顯增強(qiáng)。利用BMSCs-Exosomes刺激CSCs,是否能夠促進(jìn)CSCs活化、提高CSCs分化能力,增強(qiáng)CSCs心肌修復(fù)功能?這些問(wèn)題目前仍未有研究報(bào)道。本課題擬以Exosomes為手段預(yù)處理CSCs,旨在為提高CSCs的心肌修復(fù)功能;并進(jìn)一步通過(guò)micro RNA基因芯片檢測(cè),探討分析CSCs功能改善的基因調(diào)控機(jī)制。第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng),及Exosomes的提取第一節(jié)MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定目的:從大鼠的骨髓中分離出具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)。為進(jìn)一步獲取Exosomes作準(zhǔn)備。方法:SD大鼠全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng),多次傳代純化。對(duì)分離純化的MSCs進(jìn)行多方面鑒定:流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs表面標(biāo)記抗原的表達(dá);繪制MSCs生長(zhǎng)曲線;檢測(cè)MSCs的細(xì)胞周期。結(jié)果:全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)14天左右,基本已鋪滿培養(yǎng)皿,融合達(dá)90%以上。傳代后,細(xì)胞增殖速度明顯加快,4-6天即可傳代一次。細(xì)胞形態(tài)比較均一,呈紡錘形。流式鑒定:超過(guò)90%BMSCs表達(dá)CD29、CD90和CD44,但不表達(dá)CD34。P3 MSCs生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn):細(xì)胞接種后前2天為潛伏期生長(zhǎng);第3天,細(xì)胞開(kāi)始增殖;第4、5、6天擴(kuò)增明顯加速,進(jìn)入對(duì)數(shù)增殖期;第7天增殖達(dá)到高峰,進(jìn)入平臺(tái)期。流式細(xì)胞儀檢測(cè)P3 MSCs細(xì)胞周期:G0/G1期占88.15%,G2期為1.73%,S期(G3)為10.12%,大部分細(xì)胞處于靜止期,符合干細(xì)胞特征。結(jié)論:利用大鼠全骨髓細(xì)胞,貼壁傳代培養(yǎng),至P3可使MSCs得到純化,有效的培養(yǎng)出大鼠BMSCs。第二節(jié)BMSCs來(lái)源Exosomes的提取、鑒定目的:從P3 BMSCs培養(yǎng)上清液中提取具有特定形態(tài)、大小和膜標(biāo)記物的Exosomes。為進(jìn)一步應(yīng)用Exosomes處理CSCs做準(zhǔn)備。方法:應(yīng)用Exosomes提取試劑盒,按說(shuō)明抽提P3 BMSCs培養(yǎng)上清液中的Exosomes。利用BCA試劑盒測(cè)定Exosomes的濃度。對(duì)Exosomes進(jìn)行鑒定:透射電鏡下觀察Exosomes的大小、形態(tài);流式細(xì)胞術(shù)鑒定Exosomes表面CD63的表達(dá)量;Western Blot檢測(cè)Exosomes中CD63的蛋白表達(dá)量。結(jié)果:經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定,Exosomes蛋白濃度較高,達(dá)1896.7mg/ml。對(duì)Exosomes鑒定:透射電鏡下觀察,Exosomes大小不一、圓形或橢圓形,呈囊狀小泡,腔內(nèi)可見(jiàn)低密度光亮區(qū),平均直徑為46.55±11.64(11-98nm);經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),CD63的表達(dá)量為96.7%;經(jīng)Western Blot檢測(cè),CD63蛋白為陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)論:試劑盒抽提的Exosomes濃度較高。經(jīng)透射電鏡、流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot鑒定,符合Exosomes形態(tài)及特征。試劑盒抽提Exosomes簡(jiǎn)便、省時(shí)、高效。第二部分大鼠心肌梗死模型的建立目的:氣管插管開(kāi)胸直視下,行大鼠冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)結(jié)扎,建立大鼠心肌梗死模型。方法:17只SD大鼠,體重250g-300g,分為兩組:MI組(10只)和對(duì)照組(7只)。MI組在氣管插管下,開(kāi)胸直視結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)。判斷心梗模型是否成功建立:結(jié)扎前后檢測(cè)心電圖;術(shù)前、術(shù)后4周行多普勒超聲心動(dòng)圖檢查;術(shù)后4周獲取大鼠心臟組織,行HE染色和Masson’s Trichrome染色分析。結(jié)果:MI組大鼠手術(shù)成活率80%。冠脈結(jié)扎后,心電圖提示I、II、III、a VF導(dǎo)聯(lián)ST段抬高明顯;MI建立后4周行心臟彩超檢查,EF和FS值較對(duì)照組均明顯降低(P0.01,P0.01),LVEDD和LVESD較對(duì)照組均明顯增大(P0.01,P0.01);HE染色,MI組可見(jiàn)肌纖維增粗變性、壞死,輪廓模糊;MT染色提示MI組有大量呈藍(lán)色的膠原沉積,存活紅色心肌少見(jiàn)。結(jié)論:氣管插管開(kāi)胸,直視下結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支(LAD),可以成功建立大鼠心肌梗死(MI)模型。第三部分大鼠心臟干細(xì)胞(CSCs)的分選和培養(yǎng)目的:利用免疫磁珠分選法(MACS),從新生3-5天SD大鼠心臟中獲取c-kit+心臟干細(xì)胞(CSCs)。為進(jìn)一步研究CSCs功能作準(zhǔn)備。方法:獲得新生3-5天SD大鼠心臟,利用膠原酶消化和MACS分選法提取c-kit+CSCs,傳代培養(yǎng)。對(duì)分選的CSCs進(jìn)行鑒定:流式細(xì)胞術(shù)鑒定P0 CSCs c-kit陽(yáng)性率;免疫熒光觀察CSCs中c-kit及Ki67的表達(dá);CSC經(jīng)誘導(dǎo)分化,免疫熒光觀察c Tn I、Desmin、Connexin 43、α-SMA、CD31的表達(dá)。結(jié)果:應(yīng)用膠原酶和MACS分選法獲得的CSCs形態(tài)均一,呈小、亮、圓形或梭形,生長(zhǎng)較緩慢。經(jīng)流式鑒定,c-kit+陽(yáng)性率達(dá)91.5%;同時(shí)免疫熒光觀察到c-kit和Ki67呈陽(yáng)性表達(dá);經(jīng)誘導(dǎo)分化的CSCs,表達(dá)c Tn I、Connexin43、Desmin、α-SMA和CD31熒光。結(jié)論:利用MACS分選獲得的CSCs純度較高,具有自我更新和向心肌系細(xì)胞分化的潛能,符合CSCs形態(tài)和特征。第四部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的Exosomes對(duì)心臟干細(xì)胞功能以及心肌修復(fù)能力的影響目的:觀察經(jīng)Exosomes處理后的CSCs在遷移、血管形成、擴(kuò)增能力等方面的功能變化,及其移植治療大鼠MI心肌修復(fù)的功能作用。方法:首先,將Di I標(biāo)記的Exosomes加入CSCs培養(yǎng)基中,熒光觀察CSCs內(nèi)吞Exosomes;其次,在不同濃度Exosomes(0μg/ml,100μg/ml,200μg/ml,400μg/ml, 800μg/ml)的作用下,應(yīng)用CCK-8法觀察不同濃度Exosomes對(duì)CSCs擴(kuò)增能力的影響;應(yīng)用Transwell小室,觀察不同濃度Exosomes對(duì)CSCs遷移能力的影響;利用Matrigel基質(zhì)膠,觀察不同濃度Exosomes對(duì)CSCs血管形成能力的影響;然后,將經(jīng)400μg/ml Exosomes預(yù)處理的CSCs和正常培養(yǎng)的CSCs局部心肌注射治療大鼠MI,觀察比較Di I-CSCs在心臟中短期存活的數(shù)量;免疫熒光觀察比較心梗周邊區(qū)域新生毛細(xì)血管密度和CSCs-GFP向血管分化的數(shù)量;心臟彩超檢查觀察比較心功能變化;MT染色觀察比較心梗面積差異。結(jié)果:(1)Di I標(biāo)記的Exosomes加入CSCs培養(yǎng)基中,觀察到CSCs表面呈現(xiàn)紅色Di I熒光,說(shuō)明CSCs內(nèi)吞了Exosomes。(2)在不同濃度Exosomes(0μg/ml,100μg/ml,200μg/ml,400μg/ml,800μg/ml)的作用下,應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)CSCs的增殖能力,呈現(xiàn)為低濃度Exosomes(0μg/ml,100μg/ml)刺激,OD值變化不大;高濃度Exosomes組(200μg/ml,400μg/ml,800μg/ml)的OD值明顯高于低濃度組,但在高濃度Exosomes組的組間OD值無(wú)差異。應(yīng)用Transwell小室檢測(cè)CSCs的遷移能力,呈現(xiàn)為低濃度Exosomes(0μg/ml,100μg/ml)刺激,CSCs遷移能力無(wú)顯著變化;但隨刺激濃度增加,其遷移能力顯著增加。應(yīng)用Matrigel基質(zhì)膠檢測(cè)CSCs血管形成的能力,呈現(xiàn)為低濃度Exosomes(0μg/ml,100μg/ml)刺激,形成Tube長(zhǎng)度無(wú)顯著差異;但隨刺激濃度增加,Tube長(zhǎng)度亦顯著增加,然而400μg/ml和800μg/ml組間Tube長(zhǎng)度無(wú)差異。(3)CSCs移植治療MI,CSCsExo組CSCs-Di I短期(10天)存活量在心梗區(qū)域(IZ)和心梗周邊區(qū)域(BZ)均顯著多于CSCs組(P0.01,P0.01);CSCsExo組和CSCs組大鼠在術(shù)后28天EF值均顯著高于Control組(P0.01,P0.01);CSCsExo組BZ中新生毛細(xì)血管密度以及CSCs-GFP向血管分化的數(shù)目均明顯多于CSCs組(P0.01,P0.01);CSCsExo組心臟纖維化面積和長(zhǎng)度均顯著小于CSCs組(P0.01)。結(jié)論:在體外實(shí)驗(yàn)中,BMSCs-Exosomes具有提高CSCs擴(kuò)增、遷移和血管形成的能力,并呈濃度依賴性;Exosomes對(duì)CSCs擴(kuò)增和血管形成能力的影響具飽和性,且Exosomes濃度在400μg/ml時(shí)可達(dá)到飽和狀態(tài)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,Exosomes具有促CSCs存活、促新生毛細(xì)血管生成、促CSCs向血管分化,降低心梗面積,提高CSCs心肌修復(fù)的能力。mi RNA-326-5p在CSCs血管生成中的作用第五部分大鼠心臟干細(xì)胞的基因芯片分析及第一節(jié)大鼠心臟干細(xì)胞的基因芯片分析目的:對(duì)CSCs組和CSCsExo組兩種不同狀態(tài)的CSCs行micro RNA基因芯片檢測(cè),找出差異micro RNA進(jìn)行分析。方法:采用Affymetrix基因芯片,對(duì)CSCs組和CSCsExo組(400μg/ml Exosomes預(yù)處理)兩組細(xì)胞行大鼠micro RNA芯片表達(dá)譜檢測(cè),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。找出差異表達(dá)的micro RNA,進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果:CSCs組和CSCsExo組經(jīng)micro RNA芯片檢測(cè),差異表達(dá)的mi RNA有23個(gè),其中5個(gè)顯著下調(diào),17個(gè)顯著上調(diào)。mi R-326-5p變化最為顯著,下調(diào)7.14倍。GO分析呈現(xiàn):這些差異表達(dá)明顯的mi RNAs,它們預(yù)測(cè)的靶基因參與的細(xì)胞生物功能較為廣泛,其中包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、正性調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)增、內(nèi)吞、正性調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附、心臟發(fā)生、血管形成等。Pathway分析呈現(xiàn):差異顯著mi RNAs預(yù)測(cè)的靶基因參與廣泛的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其中包括代謝通路、內(nèi)吞作用、Wnt信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、趨化信號(hào)通路等。mi RNA-Gene-Network分析呈現(xiàn):mi R-326-5p,mi R-328a-5p,mi R-207,mi R-760-3p,mi R-702-5p這5個(gè)下調(diào)表達(dá)的mi RNA,在網(wǎng)絡(luò)圖中它們的度(Degree)最高,分別為:166、177、188、189、120,即調(diào)控的靶基因數(shù)目最多。結(jié)論:通過(guò)基因芯片檢測(cè),CSCs經(jīng)Exosomes處理后有23個(gè)mi RNA表達(dá)發(fā)生明顯變化,其中5個(gè)下調(diào),17個(gè)上調(diào)。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析,差異表達(dá)明顯的mi RNAs,它們預(yù)測(cè)的靶基因參與的生物功能包括內(nèi)吞作用、VEGF信號(hào)通路、調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)增、調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、血管形成等,這些內(nèi)容中包含了本課題中觀察到CSCs經(jīng)Exosomes處理后發(fā)生變化的功能。mi R-326-5p,mi R-328a-5p,mi R-207,mi R-760-3p,mi R-702-5p參與調(diào)控的靶基因最多,可能在本實(shí)驗(yàn)micro RNA調(diào)控CSCs功能中占主導(dǎo)地位。第二節(jié)mi RNA-326-5p在CSCs血管形成中的作用目的:進(jìn)一步驗(yàn)證mi RNA基因芯片結(jié)果中感興趣表達(dá)差異最大的mi RNA-326-5p。并探究CSCs經(jīng)Exosomes處理后,血管形成能力的增強(qiáng)是否與mi RNA-326-5p的表達(dá)變化有關(guān)?方法:通過(guò)q RT-PCR技術(shù),驗(yàn)證基因芯片結(jié)果中mi RNA-326-5p的表達(dá)情況。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),將mi RNA326-5p inhibitors轉(zhuǎn)染進(jìn)CSCs,通過(guò)q RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率;利用Matrigel基質(zhì)膠,觀察CSCs、CSCsExo(400μg/ml Exosomes處理)、CSCsmi R-326-5p i這三組Tube的形成能力。結(jié)果:經(jīng)q RT-PCR驗(yàn)證,mi RNA-326-5p在CSCsExo組中的相對(duì)表達(dá)量為0.18±0.05,明顯受到抑制。mi RNA326-5p inhibitors轉(zhuǎn)染CSCs,經(jīng)q RT-PCR驗(yàn)證mi RNA326-5p,相對(duì)表達(dá)量為0.32±0.08,抑制效率明顯超過(guò)50%。CSCsExo組和CSCsmi R-326-5p i組Tube長(zhǎng)度顯著大于CSCs組,CSCsExo組和CSCsmi R-326-5p i組組間無(wú)差異。結(jié)論:經(jīng)q RT-PCR檢測(cè),mi RNA芯片結(jié)果中mi RNA-326-5p下調(diào)顯著得到證實(shí)。下調(diào)mi R-326-5p的表達(dá)可促進(jìn)CSCs血管生成;經(jīng)Exosomes處理后,其血管形成能力的提高可能主要通過(guò)下調(diào)mi RNA-326-5p的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R542.22

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1831967