本文選題：泡沫細(xì)胞 + 膽固醇外流��； 參考：《鄭州大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分：大黃素促THP-1巨噬細(xì)胞膽固醇外流及PPAR-γ通路活化目的：動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis)是嚴(yán)重威脅人類健康的心腦血管疾病之一。巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展中扮演十分重要的角色。膽固醇攝取和外排失衡是泡沫細(xì)胞形成的一個(gè)重要原因。大黃素是一個(gè)天然的活性成分,具有廣泛的抗炎、抗腫瘤、降血脂等功效。多項(xiàng)研究表明,大黃素具有激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)通路的功能。本研究大黃素是否可通過激活PPAR-γ通路促進(jìn)巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇外流。方法：人單核細(xì)胞株THP-1應(yīng)用100 nmol/L佛波酯處理72小時(shí),分化為巨噬細(xì)胞,利用細(xì)胞免疫熒光染色檢測巨噬細(xì)胞表面抗原(Cluster of differentiation 14, CD14)、CD11b和CD11c的表達(dá)。THP-1巨噬細(xì)胞加入50μg/ml的ox-LDL和0.2 μCi/ml 3H標(biāo)膽固醇,培養(yǎng)24小時(shí),油紅O染色分析脂質(zhì)沉積。THP-1巨噬細(xì)胞加入50μg/ml ox-LDL,培養(yǎng)24小時(shí)。然后加入10μg/ml載脂蛋白A-I(ApoA-Ⅰ)和不同濃度的大黃素(0、1、5和10μM)培養(yǎng)18小時(shí)；或者加入10μg/ml ApoA-Ⅰ和10μM的大黃素培養(yǎng)0、4、8、12、16、18和24小時(shí)。對(duì)于PPAR-γ的抑制試驗(yàn),在加入大黃素之前1小時(shí)需要加入不同濃度的GW-9662(0、1、5和10μM),或者預(yù)先轉(zhuǎn)染PPlAR-γ siRNA(20、40和80 nM的)孵育24小時(shí)后加入大黃素,繼續(xù)培養(yǎng)18小時(shí)。PPAR-γ siRNA序列為：5'-GGAUGCAAGGGUUUCUUCCtt-3'和5'-GGAAGAAACCCUUGCAUCCtt-3'應(yīng)用閃爍計(jì)數(shù)法檢測培養(yǎng)液和細(xì)胞的3H膽固醇,計(jì)算膽固醇流出率。抽提細(xì)胞總RNA,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測PPAR-γmRNA表達(dá)水平變化；抽提細(xì)胞總蛋白,應(yīng)用Western blot法檢測PPAR-γ蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果：PMA孵育72小時(shí)能夠促進(jìn)THP-1細(xì)胞表達(dá)巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子CD14、CDllb和CDllc,而對(duì)照細(xì)胞不表達(dá)這些表面抗原分子。PMA刺激分化的THP-1巨噬細(xì)胞和50μg/ml的ox-LDL共同孵育后18小時(shí)后,細(xì)胞內(nèi)形成脂滴,油紅O染色呈現(xiàn)紅色圓形顆粒狀。不同濃度的大黃素(1、5和10μM)處理ox-LDL刺激的THP-1巨噬細(xì)胞18小時(shí)后,PPAR-γmRNA/β-actin mRNA的比值分別為：1.592+0.256,2.571+0.193,3.591+0.218與對(duì)照組相比(1+0.191)均顯著升高。大黃素對(duì)PPAR-γmRNA表達(dá)的促進(jìn)作用從4小時(shí)開始持續(xù)到18小時(shí),與對(duì)照相比差異十分顯著(P0.01)。不同濃度的大黃素(1、5和10μM)處理ox-LDL刺激的THP-1巨噬細(xì)胞18小時(shí)后,PPAR-γ蛋白/[-actin蛋白的比值分別為：1.419+0.296,2.617+0.252和3.417+0.296。大黃素處理組與對(duì)照組相比(1+0.162)均顯著升高。大黃素對(duì)PPAR-γ蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用在8小時(shí)后開始(2.169+0.173相對(duì)于0.976+0.105,P0.01),直到18小時(shí)(3.812+0.265相對(duì)于0.982+0.115,P0.01)。載脂蛋白A-I處理ox-LDL刺激的THP-1巨噬細(xì)胞中膽固醇的外流率為7.62+0.61%,與對(duì)照組膽固醇外流率(2.12+0.32%)相比顯著增加(P0.01)。5μM(10.74+0.93%)和10μM(16.29+1.48%)大黃素能夠顯著促進(jìn)載脂蛋白A-I誘導(dǎo)的膽固醇外流。GW9662(5-10μM)對(duì)大黃素誘導(dǎo)的膽固醇外流具有顯著的抑制效應(yīng)(P0.01)。與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染PPAR-γsiRNA后,細(xì)胞內(nèi)PPAR-γ蛋白/β-actin蛋白的比值顯著降低(P0.01)。轉(zhuǎn)染PPAR-γ特異性 siRNA(20-40μM)顯著抑制大黃素誘導(dǎo)的膽固醇外流。結(jié)論：本研究首次證實(shí)大黃素對(duì)巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇外流具有促進(jìn)功能,并且大黃素促膽固醇外流效應(yīng)與激活PPAR-γ通路有關(guān)。第二部分：大黃素通過激活LXR-α介導(dǎo)ABCA1和ABCG1轉(zhuǎn)錄促進(jìn)膽固醇外流目的：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC)家族以ATP為能源對(duì)多種底物包括各種代謝物,脂質(zhì),細(xì)胞毒素和藥物等進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。ABCA1和ABCG1通過介導(dǎo)膽固醇主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn),將膽固醇運(yùn)至apoA-I載脂蛋白,從而阻止巨噬泡沫細(xì)胞形成。肝臟X受體α(LXRα)具有與ABCA1和ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合并啟動(dòng)基因表達(dá)的能力。PPAR-γ對(duì)膽固醇外流重要基因ABCA1和ABCG1的調(diào)控作用依賴于LXR-α的轉(zhuǎn)錄活性�？紤]到PPAR-γ與LXR-α的緊密關(guān)系,本部分?jǐn)M繼續(xù)研究大黃素促膽固醇外流是否與激活LXR-α介導(dǎo)ABCA1和ABCG1轉(zhuǎn)錄有關(guān)。方法：THP-1單核細(xì)胞應(yīng)用100nmol/L佛波酯誘導(dǎo)72小時(shí)使其分化為巨噬細(xì)胞。在THP-1巨噬細(xì)胞中加入50μg/ml的ox-LDL,培養(yǎng)24小時(shí)。然后加入10μg/ml載脂蛋白A-I及不同濃度的大黃素(0、1、5和10μM)培養(yǎng)18小時(shí)；或者加入10μg/ml載脂蛋白A-I和10μM的大黃素培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)(0、4、8、12、16、18和24小時(shí))。而對(duì)于PPAR-γ的抑制試驗(yàn),在加入大黃素之前1小時(shí)需要加入不同濃度的GW-9662(0、1、5和10μM),然后再培養(yǎng)18小時(shí)。抽提細(xì)胞總RNA和總蛋白,檢測LXR-α、PPAR-γ、ABCA1和ABCG1表達(dá)變化情況。結(jié)果：RT-PCR檢測結(jié)果表明：大黃素(1、5和10μM)處理ox-LDL刺激的THP-1巨噬細(xì)胞18小時(shí)后,LXR-α mRNA/β-actin mRNA的比值分別為：1.671±0.265,2.726±0.306,3.198±0.358,這與對(duì)照組相比(1±0.188)顯著增加。Western blot檢測結(jié)果表明,不同濃度的大黃素(1、5和10μM)處理ox-LDL刺激的THP-1巨噬細(xì)胞18小時(shí)后,LXR-α蛋白/β-actin蛋白的比值分別為：1.571±0.199,2.169±0.266,2.919±0.311,而對(duì)照組為(1±0.156)。與對(duì)照組相比,10μM大黃素能夠顯著增強(qiáng)PPAR-γ蛋白表達(dá)(P0.01)。5μM和10μM的GW9662處理的細(xì)胞中的PPAR-γ蛋白/β-actin蛋白的比值與單純的大黃素處理的細(xì)胞中PPAR-y蛋白/β-actin蛋白的比值顯著減少。與此類似,GW9662也可以抑制由大黃素促進(jìn)的LXR-α蛋白的表達(dá)。不同濃度的大黃素(5和10μM)處理ox-LDL刺激的THP-1巨噬細(xì)胞18小時(shí)后,ABCA1 mRNA/p-actin mRNA的比值分別為1.761+0.296和3.266+0.334,與對(duì)照組(1+0.077)相比顯著增加；ABCGl mRNA/ β-actin mRNA的比值分別為1.662+0.207和2.952+0.326,與對(duì)照組(1+0.182)顯著增加。在蛋白水平上,不同濃度的大黃素(1、5和10μM)處理ox-LDL刺激的THP-1巨噬細(xì)胞18小時(shí)后也同樣導(dǎo)致ABCA1和ABCG1蛋白水平顯著增加。PPAR-γ特異性抑制劑GW9662(5μM和10μM)顯著抑制大黃素誘導(dǎo)的ABCA1和ABCG1蛋白表達(dá)水平。結(jié)論：本研究首次證實(shí)大黃素在巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇外流中的促進(jìn)作用與上調(diào)LXRα、ABCA1和ABCG1有關(guān)。PPAR-γ通路活化參與了大黃素誘導(dǎo)LXRα、 ABCA1和ABCG1的表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)膽固醇外流。
[Abstract]:THP - 1 macrophages were treated with 100 nmol / L phorbol ester for 72 hours , differentiated into macrophages , and cultured for 24 hours by using 100 nmol / L phorbol ester . THP - 1 macrophages were added with 50 渭g / ml ox - LDL for 24 hours .
or adding 10 渭g / ml ApoA - I and 10.mu . M of emodin for 0 , 4 , 8 , 12 , 16 , 18 and 24 hours . For the inhibition test of PPAR - . gamma . , after 24 hours of incubation with the PPlAR - . gamma siRNA ( 20 , 40 and 80 nM ) , emodin was added , and the culture was continued for 18 hours . The PPAR - 緯 siRNA sequence was 5 ' - GGCAAGGGUUUCUUCCtt - 3 ' and 5 ' - GGAAGAAACCCUUGCCtt - 3 ' . The expression level of PPAR - 緯 mRNA was detected by RT - PCR .
The effects of emodin on the expression of PPAR - 緯 mRNA in THP - 1 macrophages stimulated by ox - LDL were 1.592 + 0.296 , 2.617 + 0.252 and 3.417 + 0.296 .
Compared with the control group , the ratio of LXR - 偽 mRNA / 尾 - actin mRNA was 1.671 鹵 0.199 , 2.726 鹵 0.306 , 2.919 鹵 0.358 , and the ratio of LXR - 偽 mRNA / 尾 - actin mRNA was 1.761 鹵 0.199 , 2.726 鹵 0.306 , 2.919 鹵 0.358 , respectively .
The levels of ABCA1 and ABCG1 were significantly inhibited by the treatment of ox - LDL - stimulated THP - 1 macrophages with different concentrations of emodin ( 1 , 5 and 10 渭M ) .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R543.5

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本文編號(hào)：1753593