本文選題：泡沫細胞 + 膽固醇外流　； 參考：《鄭州大學》2015年博士論文

【摘要】：第一部分：大黃素促THP-1巨噬細胞膽固醇外流及PPAR-γ通路活化目的：動脈粥樣硬化(atherosclerosis)是嚴重威脅人類健康的心腦血管疾病之一。巨噬細胞源性泡沫細胞在動脈粥樣硬化形成和發(fā)展中扮演十分重要的角色。膽固醇攝取和外排失衡是泡沫細胞形成的一個重要原因。大黃素是一個天然的活性成分,具有廣泛的抗炎、抗腫瘤、降血脂等功效。多項研究表明,大黃素具有激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)通路的功能。本研究大黃素是否可通過激活PPAR-γ通路促進巨噬泡沫細胞膽固醇外流。方法：人單核細胞株THP-1應用100 nmol/L佛波酯處理72小時,分化為巨噬細胞,利用細胞免疫熒光染色檢測巨噬細胞表面抗原(Cluster of differentiation 14, CD14)、CD11b和CD11c的表達。THP-1巨噬細胞加入50μg/ml的ox-LDL和0.2 μCi/ml 3H標膽固醇,培養(yǎng)24小時,油紅O染色分析脂質沉積。THP-1巨噬細胞加入50μg/ml ox-LDL,培養(yǎng)24小時。然后加入10μg/ml載脂蛋白A-I(ApoA-Ⅰ)和不同濃度的大黃素(0、1、5和10μM)培養(yǎng)18小時；或者加入10μg/ml ApoA-Ⅰ和10μM的大黃素培養(yǎng)0、4、8、12、16、18和24小時。對于PPAR-γ的抑制試驗,在加入大黃素之前1小時需要加入不同濃度的GW-9662(0、1、5和10μM),或者預先轉染PPlAR-γ siRNA(20、40和80 nM的)孵育24小時后加入大黃素,繼續(xù)培養(yǎng)18小時。PPAR-γ siRNA序列為：5'-GGAUGCAAGGGUUUCUUCCtt-3'和5'-GGAAGAAACCCUUGCAUCCtt-3'應用閃爍計數(shù)法檢測培養(yǎng)液和細胞的3H膽固醇,計算膽固醇流出率。抽提細胞總RNA,應用逆轉錄PCR法檢測PPAR-γmRNA表達水平變化；抽提細胞總蛋白,應用Western blot法檢測PPAR-γ蛋白表達水平變化。結果：PMA孵育72小時能夠促進THP-1細胞表達巨噬細胞標志分子CD14、CDllb和CDllc,而對照細胞不表達這些表面抗原分子。PMA刺激分化的THP-1巨噬細胞和50μg/ml的ox-LDL共同孵育后18小時后,細胞內形成脂滴,油紅O染色呈現(xiàn)紅色圓形顆粒狀。不同濃度的大黃素(1、5和10μM)處理ox-LDL刺激的THP-1巨噬細胞18小時后,PPAR-γmRNA/β-actin mRNA的比值分別為：1.592+0.256,2.571+0.193,3.591+0.218與對照組相比(1+0.191)均顯著升高。大黃素對PPAR-γmRNA表達的促進作用從4小時開始持續(xù)到18小時,與對照相比差異十分顯著(P0.01)。不同濃度的大黃素(1、5和10μM)處理ox-LDL刺激的THP-1巨噬細胞18小時后,PPAR-γ蛋白/[-actin蛋白的比值分別為：1.419+0.296,2.617+0.252和3.417+0.296。大黃素處理組與對照組相比(1+0.162)均顯著升高。大黃素對PPAR-γ蛋白表達的促進作用在8小時后開始(2.169+0.173相對于0.976+0.105,P0.01),直到18小時(3.812+0.265相對于0.982+0.115,P0.01)。載脂蛋白A-I處理ox-LDL刺激的THP-1巨噬細胞中膽固醇的外流率為7.62+0.61%,與對照組膽固醇外流率(2.12+0.32%)相比顯著增加(P0.01)。5μM(10.74+0.93%)和10μM(16.29+1.48%)大黃素能夠顯著促進載脂蛋白A-I誘導的膽固醇外流。GW9662(5-10μM)對大黃素誘導的膽固醇外流具有顯著的抑制效應(P0.01)。與對照組相比,轉染PPAR-γsiRNA后,細胞內PPAR-γ蛋白/β-actin蛋白的比值顯著降低(P0.01)。轉染PPAR-γ特異性 siRNA(20-40μM)顯著抑制大黃素誘導的膽固醇外流。結論：本研究首次證實大黃素對巨噬泡沫細胞膽固醇外流具有促進功能,并且大黃素促膽固醇外流效應與激活PPAR-γ通路有關。第二部分：大黃素通過激活LXR-α介導ABCA1和ABCG1轉錄促進膽固醇外流目的：ATP結合盒轉運蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC)家族以ATP為能源對多種底物包括各種代謝物,脂質,細胞毒素和藥物等進行轉運。ABCA1和ABCG1通過介導膽固醇主動轉運,將膽固醇運至apoA-I載脂蛋白,從而阻止巨噬泡沫細胞形成。肝臟X受體α(LXRα)具有與ABCA1和ABCG1基因啟動子區(qū)結合并啟動基因表達的能力。PPAR-γ對膽固醇外流重要基因ABCA1和ABCG1的調控作用依賴于LXR-α的轉錄活性。考慮到PPAR-γ與LXR-α的緊密關系,本部分擬繼續(xù)研究大黃素促膽固醇外流是否與激活LXR-α介導ABCA1和ABCG1轉錄有關。方法：THP-1單核細胞應用100nmol/L佛波酯誘導72小時使其分化為巨噬細胞。在THP-1巨噬細胞中加入50μg/ml的ox-LDL,培養(yǎng)24小時。然后加入10μg/ml載脂蛋白A-I及不同濃度的大黃素(0、1、5和10μM)培養(yǎng)18小時；或者加入10μg/ml載脂蛋白A-I和10μM的大黃素培養(yǎng)不同時間點(0、4、8、12、16、18和24小時)。而對于PPAR-γ的抑制試驗,在加入大黃素之前1小時需要加入不同濃度的GW-9662(0、1、5和10μM),然后再培養(yǎng)18小時。抽提細胞總RNA和總蛋白,檢測LXR-α、PPAR-γ、ABCA1和ABCG1表達變化情況。結果：RT-PCR檢測結果表明：大黃素(1、5和10μM)處理ox-LDL刺激的THP-1巨噬細胞18小時后,LXR-α mRNA/β-actin mRNA的比值分別為：1.671±0.265,2.726±0.306,3.198±0.358,這與對照組相比(1±0.188)顯著增加。Western blot檢測結果表明,不同濃度的大黃素(1、5和10μM)處理ox-LDL刺激的THP-1巨噬細胞18小時后,LXR-α蛋白/β-actin蛋白的比值分別為：1.571±0.199,2.169±0.266,2.919±0.311,而對照組為(1±0.156)。與對照組相比,10μM大黃素能夠顯著增強PPAR-γ蛋白表達(P0.01)。5μM和10μM的GW9662處理的細胞中的PPAR-γ蛋白/β-actin蛋白的比值與單純的大黃素處理的細胞中PPAR-y蛋白/β-actin蛋白的比值顯著減少。與此類似,GW9662也可以抑制由大黃素促進的LXR-α蛋白的表達。不同濃度的大黃素(5和10μM)處理ox-LDL刺激的THP-1巨噬細胞18小時后,ABCA1 mRNA/p-actin mRNA的比值分別為1.761+0.296和3.266+0.334,與對照組(1+0.077)相比顯著增加；ABCGl mRNA/ β-actin mRNA的比值分別為1.662+0.207和2.952+0.326,與對照組(1+0.182)顯著增加。在蛋白水平上,不同濃度的大黃素(1、5和10μM)處理ox-LDL刺激的THP-1巨噬細胞18小時后也同樣導致ABCA1和ABCG1蛋白水平顯著增加。PPAR-γ特異性抑制劑GW9662(5μM和10μM)顯著抑制大黃素誘導的ABCA1和ABCG1蛋白表達水平。結論：本研究首次證實大黃素在巨噬泡沫細胞膽固醇外流中的促進作用與上調LXRα、ABCA1和ABCG1有關。PPAR-γ通路活化參與了大黃素誘導LXRα、 ABCA1和ABCG1的表達,進而增強膽固醇外流。
[Abstract]:THP - 1 macrophages were treated with 100 nmol / L phorbol ester for 72 hours , differentiated into macrophages , and cultured for 24 hours by using 100 nmol / L phorbol ester . THP - 1 macrophages were added with 50 渭g / ml ox - LDL for 24 hours .
or adding 10 渭g / ml ApoA - I and 10.mu . M of emodin for 0 , 4 , 8 , 12 , 16 , 18 and 24 hours . For the inhibition test of PPAR - . gamma . , after 24 hours of incubation with the PPlAR - . gamma siRNA ( 20 , 40 and 80 nM ) , emodin was added , and the culture was continued for 18 hours . The PPAR - 緯 siRNA sequence was 5 ' - GGCAAGGGUUUCUUCCtt - 3 ' and 5 ' - GGAAGAAACCCUUGCCtt - 3 ' . The expression level of PPAR - 緯 mRNA was detected by RT - PCR .
The effects of emodin on the expression of PPAR - 緯 mRNA in THP - 1 macrophages stimulated by ox - LDL were 1.592 + 0.296 , 2.617 + 0.252 and 3.417 + 0.296 .
Compared with the control group , the ratio of LXR - 偽 mRNA / 尾 - actin mRNA was 1.671 鹵 0.199 , 2.726 鹵 0.306 , 2.919 鹵 0.358 , and the ratio of LXR - 偽 mRNA / 尾 - actin mRNA was 1.761 鹵 0.199 , 2.726 鹵 0.306 , 2.919 鹵 0.358 , respectively .
The levels of ABCA1 and ABCG1 were significantly inhibited by the treatment of ox - LDL - stimulated THP - 1 macrophages with different concentrations of emodin ( 1 , 5 and 10 渭M ) .

【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5

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