本文選題：MEF2A　切入點：基因突變　出處：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景冠心病(CAD)在國內(nèi)外發(fā)病率和病死率均較高,一直以來是臨床及基礎(chǔ)醫(yī)學的研究熱點,其發(fā)病機制方面的研究近年來取得很大進步。冠心病作為一種多基因疾病,吸煙、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高血壓和糖尿病在冠狀動脈粥樣斑塊病變的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。隨著分子生物及遺傳檢測手段的不斷進展,遺傳關(guān)聯(lián)研究和全基因組連鎖分析發(fā)現(xiàn)了一些與CAD相關(guān)的易感基因位點和候選基因,研究已證明這些位點和基因直接參與冠心病的發(fā)病機制及相關(guān)危險因素的調(diào)控。但由于冠心病是一種多因素復雜疾病,單個易感基因在疾病發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的作用可能很弱小,這也是目前冠心病包括心肌梗死(MI)的基因研究明顯滯后于其他疾病的原因。然而以往的研究也表明,CAD/MI可以在一些家系中呈常染色體顯性遺傳。研究者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子家族成員——肌細胞特異性增強因子2A(MEF2A)參與了CAD的常染色體顯性遺傳形式,首次提出MEF2A為冠心病致病基因的觀點,引起世界學者廣泛關(guān)注。2003年,Wang Q在美國發(fā)現(xiàn)了一個符合常染色體顯性遺傳模式的白人家系,21個成員中有9個罹患冠心病,對家系成員進行全基因組分析發(fā)現(xiàn)每個CAD成員的MEF2A基因都存在突變,突變位置在第11外顯子1320到1341位點,這一位置有21個堿基缺失。在一項對207名經(jīng)冠脈造影證實的CAD/MI患者進行的基因分析研究中發(fā)現(xiàn)：1.93%的患者攜帶有MEF2A突變。這些初步的研究提示MEF2A變異參與CAD/MI的發(fā)病,但這個假設(shè)并沒有得到進一步的支持。Weng等研究者對這一觀點提出了質(zhì)疑,他們在300例早發(fā)冠心病的白種人中進行MEF2A基因的檢測,然而并未發(fā)現(xiàn)MEF2A基因多態(tài)性和冠狀動脈疾病的易感性之間的聯(lián)系。一項愛爾蘭人群MEF2A基因的大規(guī)模研究顯示,MEF2A基因第11號外顯子21-bp缺失與缺血性心臟病無相關(guān)性。分析上述兩種截然不同的研究結(jié)果,我們認為MEF2A突變可能是一種罕見的、只存在于少數(shù)家系的冠心病致病基因。MEF2A突變是否與我國的冠心病家系的發(fā)病機制相關(guān),結(jié)論將需要更多的中國CAD/MI家系基因研究來證明。目的1.根據(jù)冠心病、心肌梗死的診斷標準,在中國早發(fā)冠心病人群中篩選合適病例,進行家系調(diào)查,選擇理想的CAD/MI家系；2.研究分析冠心病家系的遺傳特征、傳統(tǒng)危險因素、脂類代謝情況、冠狀動脈病變情況；3.進行家系全基因組連鎖分析,篩選CAD/MI候選基因,基因測序,尋找有意義的基因突變；4.研究中國冠心病家系中MEF2A基因第1-11外顯子的基因突變情況,與散發(fā)冠心病及健康人群對照,分析MEF2A基因突變與我國CAD/MI家系的關(guān)系。研究方法1.通過病案檢索臨床診斷明確的早發(fā)冠心病患者,進行家系調(diào)查,篩選符合顯性遺傳特征的家系作為研究對象。研究采用的冠心病或心肌梗死的診斷標準為下述條件中至少存在兩個：(1)胸痛；(2)心電圖改變符合急性心肌梗死演變并與心肌酶／肌鈣蛋白顯著升高相一致；(3)冠狀動脈CT或冠狀動脈造影血管腔直徑狹窄率超過50%。通過篩選,確定研究家系。所有的家系成員均進行體格檢查、血液分析檢驗(血常規(guī)、肝腎功、血糖、血脂及血離子分析)、冠狀動脈病變評估,并進行標準化的隨訪,包括病史、活動耐力、藥物史和個人的生活習慣。2.收集以首發(fā)心肌梗死入院并行冠狀動脈造影檢查證實血管病變的散發(fā)冠心病患者(n=311)作為散發(fā)CAD對照組；健康對照組(n=323)是經(jīng)過冠脈造影或冠狀動脈CT排除冠心病的健康人群,且無早發(fā)冠心病家族史。3.微陣列比較基因組雜交(aCGH)分析：利用全血DNA提取試劑盒提取所有受試者的基因組DNA。aCGH分析冠心病家系中CAD/MI患者樣本中的DNA,正常人基因組DNA作為一個參考,我們用間隔5-kb的寡核苷酸微陣列高精度覆蓋整個基因組,拷貝數(shù)變異由患者cDNA樣本與正常對照之間log2比值確定。4. MEF2A基因檢測：采用Taq DNA聚合酶擴增所有家系成員MEF2A基因所有外顯子和內(nèi)含子-外顯子邊界區(qū)域。引物序列包括MEF2A基因外顯子1-11。利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)分析PCR擴增產(chǎn)物,出現(xiàn)異常條帶的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM T easy載體擴增,使用ABI 3100遺傳分析儀測序,與CAD對照組、正常對照組測序結(jié)果進行對照分析。結(jié)果1.成功篩選并確定了一個有34個家庭成員(5人死亡)的CAD/MI大家系,共包括20名女性和14名男性,該家系四代均無近親婚配。先證者是一名女性,36歲發(fā)病,冠狀動脈造影(CAG)顯示嚴重前降支病變,狹窄超過80%,無吸煙、高血壓、糖尿病及高脂血癥,符合早發(fā)冠心病診斷。此家系共發(fā)現(xiàn)7名現(xiàn)存活的CAD/MI患者,包括先證者的母親、兩個姐姐,一個哥哥、表哥和侄女均有早發(fā)冠心病(PCAD)癥狀及表現(xiàn)。2.家系成員CAD危險因素分析示：家庭中僅有幾個成員有血清總膽固醇和甘油三酯輕度升高,但血清低密度和高密度脂蛋白均正常,家庭成員均沒有吸煙、高血壓病、糖尿病和肥胖病史。多元Logistic回歸分析家系成員的年齡、體重指數(shù)、膽固醇、甘油三酯水平、空腹血糖等因素與CAD/MI均無相關(guān)性。3.家系具有以下遺傳特點：我們分析該家系的CAD/MI遺傳特點為：發(fā)病不分男女性別,符合常染色體遺傳；4代人均有發(fā)病,第3代患病人數(shù)達55.6%(5/9),患者雙親中必有一方也患病,正常親屬后代未發(fā)病,這些特點符合顯性遺傳特點。4.微陣列CGH分析：家系中7例CAD/MI患者的染色體15q26中都存在50-kb的片段染色體拷貝數(shù)差異(Iog2 ratio means-0.3),這一區(qū)域包含11個重要的基因(POTEB, CXADRP2, LOC646214, GOLGA8C,OR4M2,OR4N4, LOC650137, MEF2A, OR4F4, WASH3P and FAM138E),經(jīng)文獻檢索發(fā)現(xiàn)其中只有MEF2A基因與CAD的發(fā)病相關(guān),MEF2A成為最強的候選基因。5. MEF2A基因檢測：(1)在家系的所有成員MEF2A基因的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10外顯子SSCP分析均未發(fā)現(xiàn)有異常條帶；(2)在家系的所有7個CAD/MI患者和非CAD/MI的5個成員基因檢測均發(fā)現(xiàn)MEF2A第11外顯子存在6個堿基對(CAGCCG)缺失；(3)這6個堿基對(bp)缺失位于MEF2A基因cDNA序列的1671至1676位置；(4)第11外顯子缺失的序列之中含一個CAG序列,其前方還有n個CAG重復序列；(5)家系中沒有6-bp缺失的成員均為正常表型,未發(fā)生CAD,其他存在6-bp缺失而未發(fā)生冠心病的5名家庭成員均未滿40歲；(6)CAD對照組311個CAD患者和正常對照組323健康人的MEF2A基因外顯子11編碼區(qū)域均未發(fā)現(xiàn)6-bp缺失,也未發(fā)現(xiàn)國外研究報道過的21-bp缺失。結(jié)論1.本研究成功篩選出具有顯性遺傳特征的中國冠心病家系,年齡、血壓、吸煙、血脂、血糖、體重指數(shù)等常見危險因素與家系成員冠心病發(fā)生無相關(guān)性,證明家族遺傳因素是部分人群冠心病發(fā)生的重要原因。2.首次在中國家系研究中發(fā)現(xiàn)一種家族遺傳型冠心病與新發(fā)現(xiàn)的MEF2A基因突變密切相關(guān),這種突變是位于MEF2A基因的第11外顯子6堿基(CAGCCG)缺失,是人類MEF2A基因中發(fā)現(xiàn)一種新的突變類型。3.本研究在散發(fā)CAD及正常對照組人群中未發(fā)現(xiàn)MEF2A基因的第11外顯子6堿基(CAGCCG)缺失以及國外研究報道過的21-bp缺失,我們認為MEF2A基因第11外顯子突變與我國散發(fā)冠心病的發(fā)生無關(guān),可能是部分CAD家系的致病基因。研究背景及目的動脈粥樣硬化(AS)性疾病是當今危及人類生命和健康的主要疾病之一。在眾多的致病機制中,血管內(nèi)皮功能障礙既是動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié),也是其發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)。血糖代謝異常與動脈粥樣硬化關(guān)系十分密切。糖尿病目前是動脈粥樣硬化(AS)和冠心病(CHD)最主要的危險因素。糖尿病患者無論是否已強化降糖治療與非糖尿病患者相比,動脈粥樣硬化病變進展明顯加速。國際大規(guī)模隨機臨床實驗的結(jié)果表明,AS高危人群完全戒煙、嚴格控制血壓和血脂水平,可顯著降低心血管病發(fā)病率和死亡率。然而,ACCORD、ADVANCE和VA Diabetes trials等大規(guī)模臨床實驗顯示,在合并糖尿病的AS高危人群中將糖化血紅蛋白水平控制到正常水平,雖可降低微血管病變的發(fā)生率,但卻顯著增加大血管病變的死亡率。這些臨床實驗的結(jié)果表明：吸煙、高血壓和高膽固醇血癥與心血管事件是直線相關(guān)的因果關(guān)系,但血糖水平與心血管事件的關(guān)系并非如此。糖尿病促AS形成可能存在其它的分子機制和干預靶點,尚需更加深入的基礎(chǔ)研究加以闡明。目前研究認為,高血糖可直接損傷血管內(nèi)皮細胞,誘導黏附分子、趨化因子等炎性介質(zhì)釋放,激活炎癥反應(yīng),還可通過引起氧化應(yīng)激、脂代謝紊亂、胰島素抵抗、糖基化終產(chǎn)物增加導致血管內(nèi)皮細胞功能紊亂,是動脈粥樣硬化形成中的重要影響因素。高血糖引起血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生機制非常復雜,許多細胞因子、信號通路的作用目前還不十分明確,尋找血糖控制以外的其它干預保護措施也是防治糖尿病動脈粥樣硬化的重要環(huán)節(jié)。Kruppel樣因子(KLF)是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子的一個亞家族。研究結(jié)果顯示KLF2可以參與調(diào)節(jié)血管炎癥、凝血、血管舒縮和生成等多種過程,直接或間接保護內(nèi)皮功能,是AS形成過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子,并且是他汀類藥物的重要作用靶點,因此在AS形成過程中具有重要的作用。KLF2對糖尿病動脈粥樣硬化的影響至今尚未見有關(guān)研究報道,根據(jù)以往的基礎(chǔ)研究我們推測KLF2在高血糖與血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生機制中也應(yīng)發(fā)揮重要的作用。本研究的目的通過體外實驗探討轉(zhuǎn)錄因子KLF2在高糖條件下是否對血管內(nèi)皮功能具有重要的保護作用,闡明可能的分子機制及干預措施,為防治糖尿病動脈粥樣硬化提供重要治療靶點。材料與方法1.細胞培養(yǎng)及存活率測定：離體培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs),用不同濃度梯度及時間梯度的高糖干預,MTT比色法測定細胞存活率最終確定高糖誘導HUVEC細胞模型為25.5mmol/L的D-葡萄糖誘導24h。2.細胞干預：采用25.5mmol/L高糖及不同濃度阿托伐他汀、羅格列酮實現(xiàn)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞KLF2表達的干預,以SB203580來抑制p38MAPK活性,分別采用5.6mmol/L葡萄糖、5.6mmol/L葡萄糖+19.9 mM甘露醇干預細胞作對照組。3. RT-PCR:收集各組細胞,提取RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR,分別檢測各組細胞中KLF2、PPARγ、VCAM-1和ICAM-1 mRNA的表達水平。4. Western blotting:收集各組細胞,提取蛋白,分別檢測KLF2、VCAM-1、ICAM-1、p38MAPK、 p-p38MAPK、PPARγ的蛋白表達水平。5.NO檢測：收集各組細胞上清液,采用試劑盒檢測NO釋放。研究結(jié)果1. 與5.6mmol/L葡萄糖及5.6mmol/L葡萄糖+甘露醇組對照,25.5mmol/L高糖刺激臍靜脈內(nèi)皮細胞24h可明顯減低KLF2 mRNA及蛋白的表達,增高炎性因子VCAM-1、ICAM-1水平,減少NO的釋放,KLF2與VCAM-1、ICAM-1、NO變化趨勢顯著相關(guān)；2. 以阿托伐他汀(0.1μM,1μM,10μM)、羅格列酮(0.1μM,1μM,10μM)分別干預高糖刺激的HUVECs能明顯增加KLF2表達和NO的釋放,降低VCAM-1、 ICAM-1蛋白和mRNA表達,這種改變在阿托伐他汀組呈劑量依賴性,藥物濃度越高越明顯；3.與對照組比較,高糖刺激后的HUVECs磷酸化的p38 MAPK表達增強,給與p38 MAPK特異性抑制劑SB203580后,KLF2的表達增加；中等濃度阿托伐他汀、羅格列酮(1μM)就能明顯抑制高糖對HUVEC p38 MAPK的磷酸化作用。結(jié)論1.高濃度葡萄糖能誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞的炎癥因子VCAM-1、ICAM-1表達增加,減少舒張因子NO的釋放,導致血管內(nèi)皮功能障礙,內(nèi)皮功能保護性轉(zhuǎn)錄因子KLF2能部分抑制高濃度葡萄糖所引起的炎癥反應(yīng),保護血管內(nèi)皮功能；2.高濃度葡萄糖可以通過p38 MAPK途徑抑制HUVECs KLF2表達；3.阿托伐他汀、羅格列酮可以通過改善高糖對HUVECs轉(zhuǎn)錄因子KLF2的抑制作用,減少炎性因子VCAM-1、ICAM-1的表達,增加NO的釋放。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R541.4

【參考文獻】

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本文編號：1708565