發(fā)布時(shí)間：2018-03-23 21:44

  本文選題：Ox-LDL　切入點(diǎn)：THP-1源性巨噬細(xì)胞　出處：《南華大學(xué)》2013年碩士論文

【摘要】：目的：氧化低密度脂蛋白(oxdized low density lipoprotein, Ox-LDL)是低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）被活性氧（ROS）或者二價(jià)金屬離子（Cu~(2+)，F(xiàn)e~(2+)）氧化的產(chǎn)物。巨噬細(xì)胞通過清道夫受體吞噬Ox-LDL，，轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞，介導(dǎo)動脈粥樣硬化（Atherosclerosis, As）的形成和發(fā)展。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化斑塊中存在巨噬細(xì)胞自噬，但Ox-LDL是否調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞自噬及其調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。 方法：1. PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞24h，使分化為巨噬細(xì)胞，再分別用0，10，20，40，80mg/L的Ox-LDL處理24h，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫印跡技術(shù)（Western blot）分別檢測LC3、Beclin1、TET2的mRNA及蛋白表達(dá)情況；細(xì)胞免疫熒光檢測LC3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況；MDC染色檢測自噬囊泡的形成。 2.TET2siRNA轉(zhuǎn)染或DNA甲基化抑制劑(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-aza-CdR)處理THP-1源性巨細(xì)胞24h，再用80mg/L的Ox-LDL處理細(xì)胞24h，RT-PCR和WesternBlot分別檢測LC3、Beclin1、TET2的mRNA及蛋白的表達(dá)情況細(xì)胞免疫熒光檢測細(xì)胞內(nèi)LC3的表達(dá)；MDC染色檢測自噬囊泡形成。 結(jié)果： 1.隨著Ox-LDL濃度的增加，THP-1巨噬細(xì)胞Beclin1mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低（P0.05）；LC3mRNA表達(dá)無明顯改變（P0.05）,但其蛋白表達(dá)顯著減少（P0.001）；細(xì)胞免疫熒光結(jié)果表明隨Ox-LDL濃度的增加，LC3含量降低，MDC染色結(jié)果顯示隨著Ox-LDL的濃度增加，自噬囊泡減少。 2.TET2siRNA轉(zhuǎn)染或DNA甲基化抑制劑處理THP-1巨噬細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與80mg/L組相比，TET2siRNA組Beclin1mRNA及蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P㩳0.01），但AzadC組Beclin1mRNA及蛋白表達(dá)明顯上調(diào)；TET2siRNA組LC3的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低，但AzadC組LC3的mRNA及蛋白表達(dá)水平增加；MDC染色顯示TET2siRNA轉(zhuǎn)染組的自噬水平明顯降低；細(xì)胞免疫熒光顯示TET2siRNA轉(zhuǎn)染后，LC3在細(xì)胞內(nèi)的含量降低。 結(jié)論：Ox-LDL通過濃度依賴性下調(diào)TET2的表達(dá)抑制THP-1源性巨噬細(xì)胞自噬。
[Abstract]:Objective: oxidized low density lipoprotein (Ox-LDL) is the product of oxidizing low density lipoprotein density lipoprotein (LDLs) by reactive oxygen species (Ros) or divalent metal ions (CU). Macrophages engulf Ox-LDLthrough scavenger receptors and are transformed into macrophage-derived foam cells. Recent studies have found that macrophage autophagy exists in atherosclerotic plaques, but it is not clear whether Ox-LDL regulates macrophage autophagy and its regulatory mechanism. Methods 1. PMA induced THP-1 cells to differentiate into macrophages for 24 h, and then treated with Ox-LDL for 24 h. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting were used to detect the expression of mRNA and protein in LC3 / Beclin1 and TET2, respectively. The expression of LC3 in cells was detected by immunofluorescence staining and the formation of autophagic vesicles was detected by MDC staining. THP-1 derived giant cells were treated with 2.TET2siRNA transfection or DNA methylation inhibitor (5-Aza-2) -deoxycytidine (5-aza-CdR) for 24 h, followed by 80mg/L Ox-LDL treatment for 24 h, RT-PCR and WesternBlot were used to detect the expression of mRNA and protein in LC3Beclin1 + TET2, respectively. The expression of LC3 in the cells was detected by MDC staining for the formation of autophagic vesicles. Results:. 1. With the increase of Ox-LDL concentration, the expression of Beclin1mRNA and protein in THP-1 macrophages did not change significantly, but its protein expression decreased significantly with the increase of Ox-LDL concentration. The fruit showed that as the concentration of Ox-LDL increased, Autophagy vesicles decreased. THP-1 macrophages were treated with 2.TET2siRNA transfection or DNA methylation inhibitor. The results showed that the expression of Beclin1mRNA and protein in Tet 2 siRNA group was significantly lower than that in 80mg/L group. However, the expression of mRNA and protein in LC3 of AzadC group decreased significantly, but the mRNA and protein expression level of LC3 in AzadC group increased and the autophagy level of TET2siRNA transfected group decreased significantly. Cell immunofluorescence showed that the content of LC3 decreased after TET2siRNA transfection. Conclusion the TET2 expression was down-regulated in a dose-dependent manner by% Ox-LDL to inhibit THP-1 derived macrophage autophagy.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R543.5

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本文編號：1655294