發(fā)布時(shí)間：2018-03-22 06:12

  本文選題：生物信息學(xué)　切入點(diǎn)：心力衰竭　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：心肌細(xì)胞纖維化會(huì)導(dǎo)致包括心力衰竭、心房顫動(dòng)、心肌缺血、甚至心源性休克等心臟疾病,嚴(yán)重危害全人類的健康。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin angiotension aldostenone system,RAAS)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是心肌纖維化的主要發(fā)病機(jī)制,尤其TGF-β1是目前已知的與組織纖維化的發(fā)生關(guān)系最密切的生長(zhǎng)因子,具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制炎癥等生物學(xué)功能。Tripartite motify-containing 72(Trim72)基因共有7個(gè)外顯子(又稱為MG53,Gene ID:365377),編碼477個(gè)氨基酸,蛋白分子量為53 Kd。Trim72在慢性心衰中的作用及分子機(jī)制研究仍不清楚,故本文以SD大鼠為模型,主要研究Trim72在心衰組織中的表達(dá),對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖和遷移能力的影響及其分子機(jī)制。第一部分:基于生物信息學(xué)分析心衰中的差異表達(dá)基因目的:運(yùn)用GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)中表達(dá)譜數(shù)據(jù),結(jié)合生物信息學(xué)的方法分析在慢性心衰中的差異基因,參與的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路,尋找和心衰密切相關(guān)的基因。方法:本部分研究以GEO公共數(shù)據(jù)中的心衰表達(dá)譜數(shù)據(jù)為分析材料,運(yùn)用EC和TAC軟件分析心衰中差異表達(dá)的基因,進(jìn)一步結(jié)合生物信息學(xué)的方法分析差異基因參與的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路,mrna-mrna共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)使用cytoscape進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。利用cluego插件對(duì)基因集做kegg信號(hào)通路,geneontology,reactom通路等富集分析。結(jié)果:在獲取表達(dá)矩陣后,使用r中l(wèi)imma包分析兩兩之間的差異表達(dá)基因,共有950個(gè)差異基因,430個(gè)上調(diào)基因,520個(gè)下調(diào)基因。采用go富集分析950個(gè)差異表達(dá)基因的生物學(xué)過(guò)程,發(fā)現(xiàn)它們顯著富集于細(xì)胞增殖(cellproliferation)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑(ecm)、細(xì)胞骨架發(fā)育、刺激應(yīng)答(responsetostree)、信號(hào)調(diào)控(regulationofsignaling)、代謝調(diào)節(jié)(regulationofmetabolicprocess)等生物學(xué)過(guò)程。結(jié)合kegg數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行pathway信號(hào)通路富集分析,pathway生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,差異基因主要富集在tgfsignalingpathway、hipposignalingpathway、pi3k-aktsignalingpathway、wntsignalingpathway、cytokinereceptorinterationsignalingpathway等。結(jié)論:trim72可能在心力衰竭的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。第二部分trim72在sd大鼠心衰模型中的表達(dá)目的:構(gòu)建sd大鼠慢性心衰模型,研究trim72在sd大鼠慢性心力衰竭模型心臟組織中的表達(dá)情況,初步探討trim72在慢性心力衰竭心肌纖維化發(fā)生和進(jìn)程中的作用,為trim72在慢性心衰中的診斷和治療提供理論依據(jù)。方法:我們基于生物信息學(xué)分析的結(jié)果,預(yù)測(cè)到trim72在心臟衰竭的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用,故本部分采用腹主動(dòng)脈狹窄法誘導(dǎo)sd大鼠發(fā)生慢性心衰,采用超聲心動(dòng)、he和masson染色法鑒定心衰模型,運(yùn)用real-timepcr、westernblot和免疫組織化學(xué)等技術(shù)檢測(cè),心衰標(biāo)本和正常標(biāo)本組織中trim72mrna和蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果:采用腹主動(dòng)脈狹窄法在sd大鼠中成功復(fù)制了慢性心力衰竭,超聲心動(dòng)圖和masson染色結(jié)果顯示,sd大鼠慢性心力衰竭模型構(gòu)建成功。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,trim72在正常sd大鼠的心臟中低表達(dá)或不表達(dá),在慢性心衰sd大鼠心臟中高表達(dá)。結(jié)論:trim72在慢性心衰sd大鼠心臟中高表達(dá),有可能成為一個(gè)慢性心衰的輔助診斷標(biāo)志物。第三部分沉默mg53對(duì)sd大鼠心肌成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響目的:研究沉默trim72的表達(dá)對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖和遷移能力的影響,明確trim72在心肌成纖維細(xì)胞中的作用。方法:采用胰酶和膠原酶聯(lián)合消化sd乳鼠的心臟組織,差速貼壁離心法分離心肌成纖維細(xì)胞,形態(tài)學(xué)觀察和免疫熒光法鑒定心肌成纖維細(xì)胞。用原代分離培養(yǎng)的cfs細(xì)胞為模型,用小干擾rna技術(shù)沉默cfs細(xì)胞中trim72的表達(dá),實(shí)驗(yàn)分為3組:空白組,陰性對(duì)照組,sirna實(shí)驗(yàn)組。sirna轉(zhuǎn)染48h和72h后,realtimepcr及westernblot分別檢測(cè)trim72在mrna和蛋白水平上的干擾效果。cck-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默trim72后cfs細(xì)胞的增殖變化,transwell檢測(cè)沉默trim72后cfs細(xì)胞的遷移變化。結(jié)果:采用胰酶和膠原酶聯(lián)合消化sd乳鼠的心臟組織,差速貼壁離心法分離心肌成纖維細(xì)胞,在含10%胎牛血清dmem低糖培養(yǎng)基中常規(guī)細(xì)胞條件培養(yǎng)24h,倒置顯微鏡下可觀察到細(xì)胞形態(tài)呈多樣,細(xì)胞胞體較大、平坦,形態(tài)多為紡錘形,無(wú)自發(fā)搏動(dòng)。胞質(zhì)透明,顏色淡,顯得很薄,細(xì)胞核較大呈卵圓形,居中,細(xì)胞狀態(tài)良好,生長(zhǎng)迅速。在熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈多角形或梭形,乳鼠心肌成纖維細(xì)胞sma抗原表達(dá)呈陽(yáng)性,細(xì)胞純度大于97%。由此可以鑒定為心肌成纖維細(xì)胞。sirna轉(zhuǎn)染48和72h后,realtimepcr及westernblot結(jié)果顯示,與空白組和陰性對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組sirna能有效沉默trim72在mrna和蛋白水平上的表達(dá)。cck-8和transwell結(jié)果顯示,與空白組和陰性對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組cfs細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯下降。結(jié)論:沉默trim72的表達(dá)能抑制cfs細(xì)胞的增殖和遷移能力。第四部分初步探討trim72在心肌成纖維細(xì)胞中的分子機(jī)制研究目的:初步探討trim72在心肌成纖維細(xì)胞的增殖和遷移能力中的分子機(jī)制,尋找trim72調(diào)控的信號(hào)通路和下游靶基因。方法:本部分研究運(yùn)用基因表達(dá)譜芯片尋找trim72參與的信號(hào)通路及下游靶基因;首先,我們運(yùn)用前期篩選的trim72-sirna轉(zhuǎn)染cfs細(xì)胞,沉默trim72的表達(dá),trizol提取轉(zhuǎn)染48h后的總rna,利用大鼠基因表達(dá)譜芯片分析抑制trim72表達(dá)后基因的表達(dá)變化。然后,運(yùn)用ec和tac等軟件結(jié)合生物信息學(xué),對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行g(shù)eneontology和pathway信號(hào)通路分析,尋找trim72參與的生物學(xué)過(guò)程。結(jié)果:基因表達(dá)譜結(jié)果顯示,trim72-sirna抑制心肌成纖維細(xì)胞中trim72的表達(dá)后,共有265個(gè)基因發(fā)生顯著性變化,其中123個(gè)基因表達(dá)上調(diào),142個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。go生物信息學(xué)分析結(jié)果表明:上述差異表達(dá)的基因顯著富集于celladhesion、skeletalsystemdevelopment、Heart development和Extracellular matrix organization等生物學(xué)過(guò)程;Pathway生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示:差異表達(dá)的基因主要富集于TGF-beta signaling pathway、Cell adhesion molecules(CAMs)、Hippo signaling pathway和Calcium signaling pathway等信號(hào)通路。結(jié)論:整合差異表達(dá)的結(jié)果和GO、Pathway結(jié)果,我們推測(cè)Trim72可能通過(guò)TGF-beta signaling pathway通路發(fā)揮作用,qRT-PCR和Western blot結(jié)果也得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證。這些結(jié)果表明,Trim72可能通過(guò)上述通路和/或基因的表達(dá)變化參心肌成纖維細(xì)胞的增殖和遷移能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R541.6

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本文編號(hào)：1647400