高血壓發(fā)生機制的研究受到廣泛重視,研究表明受多系統(tǒng)、多器官、多激素以及遺傳和環(huán)境因素的多重影響。在諸多因素中,血管壁增厚性重構(gòu)是導(dǎo)致原發(fā)性高血壓的基本病理生理機制,在此過程中,[Ca~(2+)]c持續(xù)增加對興奮-轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)和VSMC表型轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。線粒體通過MCU鈣攝入及鈉/鈣、氫/鈣交換和可滲透轉(zhuǎn)換孔等[Ca~(2+)]c排出形成線粒體鈣轉(zhuǎn)運機制,維持了[Ca~(2+)]m和[Ca~(2+)]c平衡,達到緩沖和穩(wěn)定胞內(nèi)[Ca~(2+)]c的作用。因此,研究MCU鈣攝取對于線粒體鈣轉(zhuǎn)運的調(diào)控和對細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的緩沖具有十分重要的意義。本研究第一部分,選擇了攜帶tRNAIleA4263G線粒體基因突變、具有母系遺傳特征的原發(fā)性高血壓患者,提取構(gòu)建永生化淋巴細胞,就細胞的基本特征和功能、Ca~(2+)]m和[Ca~(2+)]c,特別是MCU等以及Ca~(2+)相關(guān)蛋白MICU1、VDAC、NCLX的表達與功能進行了檢測。第二部分,選擇SHR大鼠與WKY大鼠在MCU表達、鈣離子流(Ica,L)改變進行檢測；構(gòu)建SHR大鼠MCU過表達動物模型及基因沉默細胞,檢測VSMC表型轉(zhuǎn)化、[Ca~(2+)]m和[Ca~(2+)]c的變化、收縮型標志蛋白a-SMA和SMA-actin表達、以及細胞周期細胞增殖和細胞鈣離子流(Ica,L)、鈣激活鉀電導(dǎo)(GK/Ca)的改變。第一部分結(jié)果tRNAIleA4263G突變細胞系[Ca~(2+)]m水平顯著低于正常對照組細胞系,tRNAlleA4263G突變淋巴母細胞[Ca~(2+)]c與對照組比較顯示更高水平；暴露于咖啡因后,突變細胞系[Ca~(2+)]c明顯高于對照組；相反,突變細胞系[Ca~(2+)]m明顯低于對照組。2、攜帶線粒體突變細胞系與對照組相比較,tRNAIleA4263G檢測Western blot發(fā)現(xiàn)MCU表達顯著降低,表達與對照組相比較雖下降,但二者沒有顯著性MICU1差異;突變細胞系表VDAC達與對照組相比較顯著增加,目對表達量無明顯NCLX改變。處理后細胞系的[Ca~(2+)]c水平發(fā)生了增加,[3.siRNA-MCU水Ca~(2+)]m平則顯著減少,同樣進行MCU選擇性抑制劑Ru360處理后,[Ca~(2+)]m顯現(xiàn)減少,[Ca~(2+)]c顯現(xiàn)增加。第二部分1、對SHR和WKY的VSMCs進行MCU表達檢測發(fā)現(xiàn),WKY組明顯高于SHR組；SHR組VSMCs的Ica,L電流密度明顯高于WKY組；SHR組鈣通道激活曲線左移,而失活曲線右移,從而導(dǎo)致窗口電流增加。2、MCU過表達組發(fā)現(xiàn)α-SMA、SM22α和SMA-actin表達明顯增加；細胞增殖實驗和周期實驗表明MCU過表達組VSMCs與對照組相比較處于細胞增殖期。3、MCU過表達組與SHR組相比較VSMCs的[Ca~(2+)]m增加,而[Ca~(2+)]c降低。第一部分結(jié)論：1,來自攜帶tRNAlleA4263G突變的母系遺傳高血壓患者的永生淋巴細胞,其Ca~(2+)攝取明顯降低,而[Ca~(2+)]c增加,導(dǎo)致[Ca~(2+)]m/[Ca~(2+)]c匕值下降,引起細胞內(nèi)鈣超載和細胞功能改變,這可能是線粒體基因突變導(dǎo)致高血壓發(fā)生的主要機制之一。2、攜帶tRNAlleA4263G突變細胞系MCU表達顯著下調(diào),MCU是線粒體Ca~(2+)攝取的最主要元件,故我們認為線粒體基因突變導(dǎo)致線粒體Ca~(2+)攝取減少主要機制是來自線粒體MCU蛋白降低,而與MICU1無關(guān)。3、雖然攜帶tRNAIleA4263 G突變細胞的VDAC表達上調(diào),由于其對線粒體Ca~(2+)攝取和外排均有作用,故認為其在突變細胞的線粒體Ca~(2+)攝取處置中的作用有限,或可能由于mPTP外排,導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能其他損傷而引起。第二部分：1、SHR的VSMCs上MCU的表達顯著低于WKY組；過表達MCU干預(yù)細胞,使細胞向收縮型轉(zhuǎn)化或維持收縮性不變,緩解了SHR的VSMCs合成型增加,細胞增殖,這可能是血管壁增厚降低的原因。2、過表垂MCU引起SHR組VSMCs表型改變的主要原因與其增加[Ca~(2+)]m有關(guān),后者降低[Ca~(2+)]c,進而降低細胞表型轉(zhuǎn)化和細胞增殖。3.SHR的VSMCs中ICa,L的及GK/Ca的改變也在[Ca~(2+)]c平衡和后續(xù)效應(yīng)中產(chǎn)生一定作用,也需引起我們注意。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R544.1

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本文編號：1647159