本文選題：葡萄籽原花青素　切入點：缺氧性肺動脈高壓　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景缺氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是一種常見呼吸系統(tǒng)疾病,主要表現(xiàn)為肺血管阻力的增加,肺血管結(jié)構(gòu)重建,肺動脈壓力的進(jìn)行性升高。到目前為止,臨床上還沒有能夠根治肺動脈高壓的確切的治療方法,HPH已成為目前亟待研究并予以解決的一項重大難題�；钚匝�(reactive oxygen species,ROS)在HPH病理發(fā)展過程中的重要作用日益受到人們的關(guān)注。長期處于低氧狀態(tài)下會引發(fā)缺氧誘導(dǎo)動物模型的肺組織及肺動脈中產(chǎn)生大量ROS,而一些類似抗氧化酶的化合物在動物實驗中已經(jīng)證明對HPH具有良好的治療作用。因此,清除由低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的過量ROS可作為治療HPH的一種有效方法。葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)是從葡萄籽中提取的天然多酚類化合物。GSPE是迄今發(fā)現(xiàn)的植物來源的最高效的抗氧化劑之一,具有廣泛的抗自由基和氧化應(yīng)激的生理學(xué)及藥理學(xué)活性。并且GSPE在心血管諸多疾病中的保護(hù)及治療作用已得到廣泛證實。雖然GSPE已被證明具有清除ROS活性及心血管保護(hù)作用,然而GSPE對HPH是否具有抑制作用目前尚無相關(guān)報道。本課題將通過建立缺氧性肺動脈高壓動物模型來初步研究GSPE對HPH的抑制作用及其可能機(jī)制。目的通過觀察葡萄籽原花青素對缺氧性肺動脈高壓大鼠模型的肺動脈壓力的變化,右心室肥厚程度及肺血管結(jié)構(gòu)重建的影響,探討葡萄籽原花青素對缺氧性肺動脈高壓的治療作用及其可能機(jī)制。方法1.缺氧性肺動脈高壓大鼠模型的建立及分組。28只雄性Sprague-Dawley大鼠(200-250g)隨機(jī)分成4組,每組7只:(1)常氧組;(2)常氧給予GSPE組;(3)低氧組;(4)低氧給予GSPE組。第(2)和第(4)組大鼠在實驗前1周及實驗4周連續(xù)給予GSPE(每日250mg/kg)灌胃。2.大鼠肺動脈血液動力學(xué)及組織形態(tài)學(xué)檢測。將大鼠低氧處理4周后,經(jīng)右心室插入導(dǎo)管檢測右心室平均收縮壓力(rvsp)。取出大鼠心臟,分離出右心室(rv),左心室+室間隔(lv+s),計算其比值(rv/lv+s)作為右心室肥厚指標(biāo)。大鼠肺組織經(jīng)多聚甲醛固定,石蠟包埋,進(jìn)行he染色。用imageproplus病理圖像分析系統(tǒng)測量肺動脈外徑、內(nèi)徑、中膜面積、血管面積,并計算中膜厚度(wt%)及面積(wa%)百分比以代表肺動脈增厚程度。3.大鼠肺組織免疫組化染色。大鼠肺組織經(jīng)固定、包埋后利用α-肌動蛋白(α-sma)抗體及pcna抗體進(jìn)行免疫組化染色。4.測定肺組織及血清中的丙二醛(mda)和超氧化物歧化酶(sod)含量。5.原代肺動脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)及分組。利用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代肺動脈平滑肌細(xì)胞(pasmcs),并取3至6代用于實驗。將細(xì)胞分成6組:常氧組;低氧組;低氧+20μg/mlgspe組;低氧+40μg/mlgspe組;低氧+80μg/mlgspe組;以及低氧+120μg/mlgspe組。6.檢測各組pasmcs中的ros含量。將細(xì)胞在常氧或低氧條件下培養(yǎng)12小時后,利用dcfh-da探針及流式細(xì)胞儀檢測各組pasmcs中的ros含量。7.利用臺盼藍(lán)排斥實驗檢測pasmcs在低氧條件下的增生情況以及葡萄籽原花青素對pasmcs增生的抑制作用。8.應(yīng)用westernblot技術(shù)檢測各組pasmcs中的p-stat3、cyclind1,以及cyclind3蛋白的表達(dá)情況。9.應(yīng)用qrt-pcr技術(shù)檢測各組大鼠肺組織及pasmcs中的nox4mrna的表達(dá)變化。結(jié)果1.低氧組大鼠rvsp、rv/lv+s、wt%,以及wa%明顯高于常氧組及常氧+gspe組大鼠,然而低氧+gspe組大鼠rvsp、rv/lv+s、wt%,以及wa%均明顯低于單純低氧組大鼠。2.通過image-proplus圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析顯示,低氧組大鼠肺動脈α-sma光密度值明顯高于常氧組及常氧+gspe組大鼠,而低氧+gspe組大鼠肺動脈α-sma光密度值則明顯低于單純低氧組大鼠肺動脈α-sma光密度值。3.低氧組大鼠肺組織及血清中的SOD含量較常氧組及常氧+GSPE組明顯降低,而MDA含量則明顯增高。在給予GSPE治療后,大鼠肺組織及血清中的SOD含量明顯增高,而MDA含量則明顯降低。4.在體外實驗中,流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,與常氧組相比較,低氧組PASMCs內(nèi)的ROS含量明顯升高,然而低氧+GSPE組PASMCs內(nèi)的ROS含量較低氧組明顯降低。5.低氧組大鼠肺組織及低氧組PASMCs中的NOX4 mRNA水平較常氧組大鼠肺組織及常氧組PASMCs明顯增高,而低氧+GSPE組大鼠肺組織及低氧+GSPE組PASMCs中的NOX4 mRNA水平較低氧組大鼠肺組織及低氧組PASMCs明顯降低。6.低氧組大鼠肺動脈中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于常氧組及常氧+GSPE組大鼠肺動脈中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)。另外,與常氧組相比較,低氧明顯促進(jìn)了低氧組PASMCs的增生。在給予GSPE治療后,不但低氧組大鼠肺動脈中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少,低氧+GSPE組PASMCs的增生明顯受到了抑制。7.與常氧組相比較,低氧組PASMCs的p-STAT3、cyclin D1以及cyclin D3的蛋白表達(dá)明顯升高,低氧+GSPE組PASMCs的p-STAT3、cyclin D1以及cyclin D3的蛋白表達(dá)較低氧組明顯下降。結(jié)論1.葡萄籽原花青素抑制了低氧誘導(dǎo)的缺氧性肺動脈高壓模型大鼠的肺動脈結(jié)構(gòu)重建及肺動脈壓力的升高。2.葡萄籽原花青素抑制了低氧誘導(dǎo)的缺氧性肺動脈高壓模型大鼠的氧化壓力。3.葡萄籽原花青素降低了低氧誘導(dǎo)的NOX4 mRNA在肺動脈平滑肌細(xì)胞及肺組織中的高表達(dá)。4.葡萄籽原花青素抑制了低氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞的過度增生。背景缺氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是以肺動脈的持續(xù)收縮、結(jié)構(gòu)重建及肺動脈壓力進(jìn)行性升高為特征的一種嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病。由低氧引起的肺部炎癥反應(yīng)及肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)的過度增生,在HPH的病理發(fā)展過程中起著非常重要的作用。褪黑激素(melatonin),屬于吲哚雜環(huán)類化合物,是主要由松果體分泌的一類內(nèi)分泌激素。大量研究證明,褪黑激素在機(jī)體的一些重要的生理和病理發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,如調(diào)節(jié)機(jī)體的晝夜節(jié)律、抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、抑制炎癥、抑制細(xì)胞過度增生等。在心血管系統(tǒng),褪黑激素的保護(hù)作用主要是通過清除活性氧自由基、抗氧化功能。雖然褪黑激素具有保護(hù)心血管、抑制炎癥、抑制細(xì)胞增生的作用,但褪黑激素是否能夠抑制HPH的發(fā)生與發(fā)展、抑制HPH中的炎癥反應(yīng)及PASMCs的過度增生,到目前為止尚無相關(guān)報道。本課題將通過建立缺氧性肺動脈高壓動物模型來初步研究褪黑激素對HPH的抑制作用及其可能機(jī)制。目的通過觀察褪黑激素對缺氧性肺動脈高壓大鼠模型的肺動脈壓力的變化,右心室肥厚程度及肺血管結(jié)構(gòu)重建的影響,探討褪黑激素對缺氧性肺動脈高壓的治療作用及其可能機(jī)制。方法1.缺氧性肺動脈高壓大鼠模型的建立及分組28只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分成4組,每組7只:(1)常氧組;(2)常氧給予褪黑激素組;(3)低氧組;(4)低氧給予褪黑激素組。第(2)和第(4)組大鼠在實驗前1周及實驗4周連續(xù)給予褪黑激素(每日15mg/kg)腹腔注射。2.大鼠肺動脈血液動力學(xué)及組織形態(tài)學(xué)檢測將大鼠低氧處理4周后,經(jīng)右心室插入導(dǎo)管檢測右心室平均收縮壓力(RVSP)。取出大鼠心臟,分離出右心室(RV),左心室+室間隔(LV+S),計算其比值(RV/LV+S)作為右心室肥厚指標(biāo)。大鼠肺組織經(jīng)多聚甲醛固定,石蠟包埋,進(jìn)行HE染色。用Image Pro Plus病理圖像分析系統(tǒng)測量肺動脈外徑、內(nèi)徑、中膜面積、血管面積,并計算中膜厚度(WT%)及面積(WA%)百分比以代表肺動脈增厚程度。3.大鼠肺組織免疫組化染色大鼠肺組織經(jīng)固定、包埋后利用α-肌動蛋白(α-SMA)抗體、PCNA抗體、HIF-1α抗體,以及NF-κB p65抗體進(jìn)行免疫組化染色。4.原代肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)的培養(yǎng)及低氧處理利用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代PASMCs,并取3至6代用于實驗。實驗中將細(xì)胞在21%氧或2%氧條件下持續(xù)培養(yǎng)48小時。5.利用MTT實驗檢測PASMCs在低氧條件下的增生情況以及褪黑激素對PASMCs增生的抑制作用。6.應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測常氧及低氧條件下的PASMCs中的p-Akt和pERK,以及肺組織中NF-κB p65蛋白的表達(dá)情況。7.應(yīng)用q RT-PCR技術(shù)檢測各組大鼠肺組織中的HIF-1αm RNA的表達(dá)變化。結(jié)果1.低氧組大鼠RVSP、RV/LV+S、WT%,以及WA%明顯高于常氧組及常氧+褪黑激素組大鼠,然而低氧+褪黑激素組大鼠RVSP、RV/LV+S、WT%,以及WA%均明顯低于單純低氧組大鼠。2.通過Image-Pro Plus圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析顯示,低氧組大鼠肺動脈α-SMA光密度值及PCNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于常氧組及常氧+褪黑激素組大鼠,而低氧+褪黑激素組大鼠肺動脈α-SMA光密度值及PCNA陽性細(xì)胞數(shù)則明顯低于單純低氧組大鼠。3.低氧明顯提高了HIF-1α在肺動脈中層平滑肌細(xì)胞中的表達(dá),以及HIF-1αm RNA在肺組織中的表達(dá)。然而褪黑激素明顯抑制了HIF-1α的表達(dá)水平。4.低氧組大鼠肺組織中NF-κB p65的表達(dá)水平較常氧組明顯升高,褪黑激素明顯抑制了NF-κB p65在肺組織中的表達(dá)。5.與常氧組相比較,低氧明顯促進(jìn)了低氧組PASMCs的增生。在給予褪黑激素后,PASMCs的增生明顯受到了抑制。6.與常氧組相比較,低氧組PASMCs的p-Akt和p-ERK的蛋白表達(dá)明顯升高,低氧+褪黑激素組PASMCs的p-Akt和p-ERK的蛋白表達(dá)較低氧組明顯下降。結(jié)論1.褪黑激素抑制了低氧誘導(dǎo)的缺氧性肺動脈高壓模型大鼠的肺動脈結(jié)構(gòu)重建及肺動脈壓力的升高。2.褪黑激素抑制了低氧誘導(dǎo)的缺氧性肺動脈高壓模型大鼠的肺部炎癥反應(yīng)。3.褪黑激素抑制了低氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞的過度增生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R544.1

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本文編號：1586405