本文選題：致心律失常性右室心肌病　切入點(diǎn)：橋粒芯糖蛋白2　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分DSG2基因沉默對(duì)小鼠P19向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響背景:致心律失常性心肌病(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy,ARVC)的特征性病理改變是心肌進(jìn)行性地被纖維或纖維脂肪組織替代。約50%的ARVC患者攜帶有橋�；蛲蛔��；蛎\(yùn)圖譜和譜系示蹤方法證實(shí),ARVC的右室脂肪細(xì)胞來(lái)源于第二生心區(qū)前體細(xì)胞。已有研究報(bào)道心臟前體細(xì)胞過(guò)表達(dá)PG可使PG核內(nèi)定位增加,從而引起脂肪相關(guān)基因表達(dá)增加,并促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)脂滴生成。我們先前的研究發(fā)現(xiàn),DSG2基因沉默心房腫瘤細(xì)胞系HL-1細(xì)胞后,細(xì)胞的纖維相關(guān)指標(biāo)(Col1a1,Col1a2,Col3a1)、脂肪相關(guān)指標(biāo)(Adiponectin,PPAR-γ,C/EBP-α)以及細(xì)胞凋亡顯著增加,出現(xiàn)類似于人類ARVC的分子改變。然而,ARVC疾病中DSG2與心臟前體細(xì)胞脂肪生成的關(guān)系尚不明確。目的:以小鼠P19細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,探討應(yīng)用96孔板懸浮法誘導(dǎo)P19細(xì)胞體外向脂肪細(xì)胞分化的可行性和有效性,并分析DSG2基因沉默對(duì)P19細(xì)胞分化的類脂肪細(xì)胞脂肪相關(guān)基因m RNA表達(dá)水平的影響。方法:P19細(xì)胞使用96孔板懸浮培養(yǎng)法制備擬胚體(embryonic bodies,EBs),其中第3天至第5天使用誘導(dǎo)劑全反式維甲酸(All trans-retinoic acid,at RA)。第7天挑取EBs用胰島素和三碘甲狀腺原氨酸(3,3’,5-triiodo-L-thyronine,T3)誘導(dǎo),繼續(xù)貼壁培養(yǎng)20天后,油紅O染色鑒定分化細(xì)胞的特征,分別于貼壁期第5、10、15、20天提取總RNA,熒光定量PCR檢測(cè)誘導(dǎo)分化過(guò)程中脂肪相關(guān)基因(Adiponectin,PPAR-γ,C/EBP-α)的表達(dá)變化。設(shè)計(jì)并合成針對(duì)DSG2基因編碼區(qū)的干擾序列,構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞,遺傳霉素(geneticin,G418)篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,熒光定量PCR檢測(cè)DSG2的沉默效率,并觀察沉默效率最佳的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株分化的類脂肪細(xì)胞脂肪相關(guān)基因m RNA表達(dá)水平的改變。結(jié)果:使用96孔板懸浮培養(yǎng)法可以形成大小均一的EBs,誘導(dǎo)結(jié)束后EBs生長(zhǎng)暈周圍部分細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)趨于類圓或圓形,胞質(zhì)中出現(xiàn)小脂滴,可被油紅O染色清晰顯示,同時(shí)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示與未分化的P19細(xì)胞相比,誘導(dǎo)分化結(jié)束時(shí)PPARγ、C/EBPα和adiponectin的表達(dá)量分別增加了50.57倍(P0.01)、21.65倍(P0.01)和168.89倍(P0.01)。Sh DSG2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞后,篩選出對(duì)DSG2基因m RNA表達(dá)抑制效率最顯著的Sh DSG2-1373組(68.06%,P0.01),誘導(dǎo)其向脂肪細(xì)胞分化后,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組Sh DSG2-si NC組相比,Sh DSG2-1373組分化的類脂肪細(xì)胞脂肪相關(guān)基因m RNA的表達(dá)明顯增加,PPARγ、C/EBPα、adiponectin分別上調(diào)了16.24倍(P0.01)、7.67倍(P0.01)和29.05倍(P0.01)。結(jié)論:使用96孔板懸浮法獲得的P19細(xì)胞EBs在體外可誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。DSG2基因沉默明顯增加P19細(xì)胞分化的類脂肪細(xì)胞脂肪相關(guān)基因m RNA的表達(dá),提示DSG2可能參與ARVC的脂肪生成。第二部分心臟特異表達(dá)DSG2-F536C轉(zhuǎn)基因小鼠的表型進(jìn)展研究背景:我們對(duì)一個(gè)中國(guó)漢族ARVC家系臨床隨訪中發(fā)現(xiàn)家系中ARVC患者表現(xiàn)出典型的心電圖改變和超聲心動(dòng)圖的演變,通過(guò)基因篩查篩選出一個(gè)高度保守的DSG2-F531C錯(cuò)義突變,可導(dǎo)致第531位的半胱氨酸被丙氨酸替代。隨后,我們建立了相應(yīng)突變的心臟組織特異性表達(dá)DSG2-F536C轉(zhuǎn)基因小鼠模型,對(duì)其表型分析發(fā)現(xiàn)突變型轉(zhuǎn)基因小鼠于出生后6周開始出現(xiàn)射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF)和短軸收縮率(fractional shortening,FS)下降,Masson染色示左心室出現(xiàn)局灶性纖維化,出現(xiàn)類似ARVC表型,提示我們DSG2-F531C突變是具有致病性的突變,然而該突變對(duì)ARVC疾病進(jìn)展的影響尚不明確。目的:比較15周齡和30周齡轉(zhuǎn)基因小鼠心臟纖維化及心室電重構(gòu)相關(guān)的Connexin43表達(dá)和定位的變化,明確DSG2-F531C對(duì)ARVC疾病進(jìn)展的影響。方法:以心臟特異性表達(dá)DSG2轉(zhuǎn)基因小鼠(W39)為對(duì)照組,心臟特異性表達(dá)DSG2-F536C轉(zhuǎn)基因小鼠(M35)為實(shí)驗(yàn)組,Masson染色對(duì)比觀察15周齡和30周齡轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織學(xué)改變;免疫組化評(píng)價(jià)Connexin43表達(dá)和定位的變化。結(jié)果:轉(zhuǎn)基因小鼠的纖維沉積局限于左心室游離壁,右心室及室間隔心肌細(xì)胞間未見明顯藍(lán)色纖維組織。15周齡時(shí),W39組小鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,排列整齊有序,細(xì)胞間隙未見明顯膠原纖維存在,M35組小鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚清晰,排列稍紊亂,心肌細(xì)胞間隙膠原纖維沉積明顯增加;30周齡時(shí),W39組小鼠未見明顯膠原沉積,而M35組小鼠正常心肌排列破壞,細(xì)胞間質(zhì)可見大量膠原纖維沉積,將心肌細(xì)胞分散包裹形成一個(gè)個(gè)隔離島樣結(jié)構(gòu)。膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction,CVF)示W(wǎng)39組小鼠15周齡與30周齡時(shí)的CVF無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.44%vs 0.64%,P0.05),15周齡M35組小鼠CVF較同齡對(duì)照組明顯升高(5.52%vs 0.44%,P0.05),且30周齡M35組小鼠CVF較15周齡同組小鼠明顯增多(15.10%vs 5.52%,P0.05)。免疫組化染色示轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組(W39)和實(shí)驗(yàn)組(M35)Connexin43仍定位在閏盤區(qū),心肌細(xì)胞側(cè)膜及胞質(zhì)內(nèi)均無(wú)陽(yáng)性著色,但閏盤區(qū)的Connexin43表達(dá)較陽(yáng)性參照均明顯下調(diào),兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:DSG2-F536C轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出年齡依賴性的心肌纖維化表型,證實(shí)DSG2-F531C致病突變導(dǎo)致的ARVC是進(jìn)展性心肌病。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R542.2

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