本文關(guān)鍵詞： 寒冷 血管緊張素Ⅱ 高血壓 線粒體 薄荷醇 辣椒素 TRP通道　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景和目的:高血壓和冠狀動脈粥樣硬化是臨床的常見病和多發(fā)病,嚴重危害人類健康。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)高鹽、高脂和高糖等不健康飲食以及寒冷氣候是導(dǎo)致心血管病發(fā)生和加重的危險環(huán)境因素。其中寒冷氣候是導(dǎo)致高血壓的重要環(huán)境因素,且不易改變。冬季心腦血管發(fā)病率及相關(guān)事件顯著增加,寒冷應(yīng)激導(dǎo)致心血管系統(tǒng)的改變以血壓升高為主,可導(dǎo)致寒冷性高血壓(cold-induced hypertension,CIH)。而高脂飲食會引起血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷促進動脈粥樣硬化的發(fā)生。因此,闡明環(huán)境因素導(dǎo)致血管損傷的機制對高血壓和動脈粥樣硬化的防治有重要意義。線粒體功能障礙導(dǎo)致的血管氧化應(yīng)激損傷是引起高血壓和動脈粥樣硬化發(fā)病的重要病理生理基礎(chǔ)。線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)能協(xié)同調(diào)節(jié)胞漿和線粒體的鈣離子(Ca~2+)濃度,胞漿鈣離子濃度增加能升高線粒體鈣離子濃度。細胞內(nèi)鈣超載伴隨ROS的產(chǎn)生增加。血管緊張素Ⅱ和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)干預(yù)會損傷線粒體呼吸功能導(dǎo)致ROS生成大量增加。線粒體功能異常是導(dǎo)致細胞氧化應(yīng)激損傷的主要原因,其中Ca~2+內(nèi)流增加起關(guān)鍵作用。在血管平滑肌細胞線粒體ROS可激活胞膜上的L-型Ca~2+通道促進細胞外Ca~2+內(nèi)流,激活RhoA和Rho激酶信號通路,進一步促進血管平滑肌收縮增加血管張力。血管內(nèi)皮細胞ROS過量生成會導(dǎo)致一氧化氮生物利用度降低,損傷血管功能。使用線粒體特異性的ROS清除劑能有效降低ROS水平并改善上述病理生理改變。瞬時受體電位通道[Transient receptor potential(TRP)channels]是一類非選擇性陽離子通道超家族,在哺乳動物不同組織細胞廣泛表達。TRP通道有分為TRPCs、TRPVs、TRPPs和TRPMs等多個亞型。其中Trpm8和Trpv1對溫度敏感,又被稱為溫度敏感性TRP通道(Thermo-TRPs)。Trpm8能被10℃~23℃的寒冷溫度及薄荷醇激活介導(dǎo)冷感覺,故Trpm8又稱為冷通道。Trpv1可被高于43℃的溫度及食物中的辛辣刺激成分激活辣椒素激活,故Trpv1又稱為辣椒素受體。近年研究發(fā)現(xiàn)激活Trpm8/v1在調(diào)控細胞Ca~2+信號中起重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)棕色脂肪有大量Trpm8表達,激活血管組織Trpm8能抑制血管收縮反應(yīng),長期薄荷醇膠囊干預(yù)能顯著降低高血壓前期受試者的血壓及改善血管舒張功能,且心率也有降低。激活Trpv1可激活Ca~2+敏感的PKA調(diào)節(jié)eNOS活性,促進NO生成改善血管功能。我們及他人既往研究提示激活Trpm8或Trpv1可調(diào)控血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞的線粒體功能,改善高鹽、高糖等環(huán)境代謝因素導(dǎo)致的心血管損傷中起著重要的作用。因此,我們推測激活Trpm8可通過改善血管平滑肌細胞線粒體功能拮抗寒冷導(dǎo)致的血管功能障礙和高血壓;激活Trpv1可緩解ox-LDL導(dǎo)致的內(nèi)皮細胞線粒體功能障礙。本研究分兩部分進行。第一部分為激活Trpm8調(diào)控線粒體功能拮抗寒冷性高血壓的機制研究。第二部為激活Trpv1改善ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮線粒體功能障礙的研究。探討了膳食因子激活TRP通道在拮抗環(huán)境因素導(dǎo)致的心血管損傷中的作用。材料方法:本研究由離體和在體兩部分實驗組成。離體實驗以原代小鼠胸主動脈血管平滑肌細胞、胸主動脈、腸系膜動脈和人臍靜脈內(nèi)皮細胞為研究對象。在體實驗采用寒冷(4℃冷刺激24周,每天干預(yù)4小時)和血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)(0.7 mg/kg per day,14天)的C57BL/6J背景的野生型(wild type,WT)和Trpm8基因敲除(Trpm8-/-)小鼠建立高血壓小鼠模型,給予普通飼料(普食組)或0.5%的薄荷醇飼料(薄荷醇組)喂養(yǎng)。1.原代培養(yǎng)小鼠胸主動脈血管平滑肌細胞,用免疫熒光和蛋白免疫印跡檢測Trpm8在血管平滑肌細胞的定位,以及Trpv1在臍靜脈內(nèi)皮細胞的定位。結(jié)合超速離心和測鈣鑒定血管平滑肌細胞Trpm8在肌漿網(wǎng)的表達及功能。2.建立寒冷性高血壓小鼠模型和血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓小鼠模型,給予普通飼料或薄荷醇飼料喂養(yǎng)。采用鼠尾血壓測量方法監(jiān)測小鼠鼠尾血壓變化。干預(yù)結(jié)束后應(yīng)用無線遙測信號檢測小鼠24小時動態(tài)血壓。3.采用小動物超聲檢測小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能。進行跑臺耐力測試(15°斜坡)檢測小鼠心臟功能。干預(yù)結(jié)束后處死取胸主動脈檢測ROS生成情況;分離腸系膜動脈檢測血管功能的變化。4.應(yīng)用鈣指示劑檢測薄荷醇和血管緊張素Ⅱ干預(yù)對血管平滑肌細胞胞漿鈣和線粒體鈣的影響。5.應(yīng)用ROS熒光指示劑檢測薄荷醇和血管緊張素Ⅱ干預(yù)對血管平滑肌細胞ROS生成的影響;以及辣椒素和ox-LDL處理對血管內(nèi)皮細胞ROS水平的影響6.采用高分辨率呼吸測定儀檢測薄荷醇和血管緊張素Ⅱ干預(yù)對血管平滑肌細胞線粒體呼吸鏈氧化磷酸化功能和ROS生成的影響。7.采用高分辨率呼吸測定儀檢測辣椒素和ox-LDL對血管內(nèi)皮細胞線粒體呼吸鏈氧化磷酸化功能的影響。采用JC-1法檢測線粒體膜電位。8.蛋白免疫印跡法檢測薄荷醇和血管緊張素Ⅱ?qū)ρ芷交〖毎鸕ho A/Rho激酶信號通路相關(guān)蛋白(RhoA、Rho A-GTP、MYPT-1、p-MYPT-1、MLC、p-MLC)表達的影響。9.蛋白免疫印跡法檢測辣椒素和ox-LDL對血管內(nèi)皮細胞PKA/UCP2信號號通路相關(guān)蛋白及線粒體蛋白(PKA、p-PKA、UCP2和NDUFA9)表達的影響。結(jié)果:1.Trpm8在血管平滑肌細胞胞膜和肌漿網(wǎng)有表達,激活Trpm8可介導(dǎo)肌漿網(wǎng)鈣釋放增加線粒體鈣攝取。2.血管緊張素Ⅱ可導(dǎo)致血管平滑肌細胞線粒體呼吸功能障礙及ROS大量生成,激活L-型Ca~2+通道介導(dǎo)細胞外Ca~2+內(nèi)流增加,促進線粒體Ca~2+攝取增加。3.薄荷醇激活血管平滑肌細胞Trpm8可減少ROS生成,抑制L-型Ca~2+通道介導(dǎo)的細胞外Ca~2+內(nèi)流和線粒體Ca~2+攝取,改善血管緊張素Ⅱ?qū)е碌木�粒體功能受損,而對Trpm8-/-血管平滑肌細胞無效。4.薄荷醇激活血管平滑肌細胞Trpm8可抑制血管緊張素Ⅱ上調(diào)Rho A-GTP/RhoA、p-MYPT-1/MYPT-1和p-MLC/MLC比值的作用,而對Trpm8-/-血管平滑肌細胞無效。5.長期薄荷醇膳食干預(yù)能減少血管組織ROS的生成及RhoA-GTP/Rho A、p-MYPT-1/MYPT-1和p-MLC/MLC比值的升高,而對Trpm8-/-小鼠無效。6.辣椒素激活血管內(nèi)皮細胞Trpv1能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞線粒體呼吸功能降低和ROS生成增加,使用Trpv1的抑制劑iRTX,PKA抑制劑KT5720或UCP2抑制劑Genipin抑制可阻斷辣椒素的作用。7.辣椒素可上調(diào)血管內(nèi)皮細胞p-PKA/PKA、UCP2和NDUFA9的表達,使用Trpv1抑制劑i RTX,PKA抑制劑KT5720或UCP2抑制劑Genipin抑制可阻斷辣椒素的作用。結(jié)論:1.溫度敏感的Trpm8在血管平滑肌細胞胞膜和肌漿網(wǎng)均有表達,激活Trpm8可改善血管線粒體功能。2.激活溫度敏感的Trpm8可改善冷應(yīng)激或血管緊張素Ⅱ?qū)е碌难芄δ苁軗p,降低血壓。3.激活溫度敏感的Trpv1可拮抗ox-LDL導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細胞線粒體功能障礙,改善血管內(nèi)皮功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R54

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本文編號：1517923