本文關(guān)鍵詞： MMP-9 p38 MAPK 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 ACE　出處：《廣東藥科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景心血管重構(gòu)(Cardiovascular remodeling)是心血管應(yīng)對(duì)多種心血管病導(dǎo)致的心肌和血管損害或負(fù)荷增加所產(chǎn)生的一系列不適當(dāng)結(jié)構(gòu)改變,是心力衰竭、高血壓等心血管疾病的重要病理基礎(chǔ)。研究心血管重構(gòu)的機(jī)制,對(duì)于防治心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensin-aldosterone System,RAAS)是一組存在于循環(huán)及組織里相互作用又相互影響的內(nèi)分泌系統(tǒng),在高血壓及心血管重構(gòu)等方面的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵性作用。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)是RAAS的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化酶,它能將血管緊張素Ⅰ(AngiotensinⅠ,AngⅠ)羧基端的二肽水解生成具有收縮血管作用的血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)。ACE在心血管重構(gòu)的作用主要是通過(guò)增加AngⅡ的生成實(shí)現(xiàn)的。循環(huán)的AngⅡ可以收縮血管和促進(jìn)醛固酮分泌進(jìn)而升高血壓;組織通過(guò)自分泌和旁分泌方式促進(jìn)局部RAAS激活,組織的AngⅡ主要參與組織的重構(gòu)�；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一個(gè)可特異性降解細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellar matrix,ECM)的鋅離子(Zn2+)依賴(lài)性肽鏈內(nèi)切酶家族。基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)是MMPs中的重要成員,廣泛分布于心血管系統(tǒng)中,參與多種生理和病理過(guò)程,包括胚泡著床、炎癥、潰瘍、心血管重構(gòu)等。在高血壓、心肌病及心肌梗死等心血管疾病中都存在著MMP-9增高的現(xiàn)象,增高的MMP-9可以促進(jìn)ECM中的膠原成分分解,導(dǎo)致心室壁抵抗力下降,心臟擴(kuò)張及心功能障礙等。雖然既往研究已顯示RAAS和MMPs各自對(duì)心血管重構(gòu)有著重要作用,但兩者的相互作用對(duì)心血管重構(gòu)的影響尚未完全明了。目前RAAS激活可以促進(jìn)MMP-9的表達(dá)并導(dǎo)致心血管重構(gòu)的證據(jù)較多。例如,對(duì)小鼠輸注AngⅡ可以上調(diào)MMP-9表達(dá),并出現(xiàn)心肌肥厚;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Angiotensin Converting Enzyme inhibitors,ACEI)類(lèi)藥物抑制MMP-9的表達(dá)而逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)等。但關(guān)于MMP-9能否作用于RAAS導(dǎo)致心血管重構(gòu)的研究還比較有限。既往研究?jī)H在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MMP-9可降解AngⅠ成為AngⅡ。我們課題組的前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)注射外源性重組MMP-9后可引起大鼠血壓升高、心室重構(gòu),并且檢測(cè)到體內(nèi)ACE明顯增多。這提示,MMP-9可能可以上調(diào)ACE表達(dá)激活RAAS,從而引起或加重心血管重構(gòu)。如果MMP-9可以上調(diào)ACE表達(dá),那它通過(guò)什么路徑介導(dǎo)呢?在眾多介導(dǎo)ACE表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中,以p38 MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)信號(hào)通路與之聯(lián)系最為緊密。p38 MAPK信號(hào)通道屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中的一員。MAPK是細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)之一,可以將細(xì)胞外刺激信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞胞質(zhì)及胞核內(nèi),參與細(xì)胞生理病理過(guò)程的調(diào)節(jié)。研究已證明,p38 MAPK可以介導(dǎo)上調(diào)ACE的表達(dá),但未明確MMP-9是否也通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通道上調(diào)ACE的表達(dá)。曾有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),THP-1巨噬細(xì)胞在ox-LDL誘導(dǎo)下可增強(qiáng)p38 MAPK的表達(dá),這種現(xiàn)象可以被MMP-9阻滯劑所抑制。因此我們推斷,MMP-9調(diào)節(jié)ACE的表達(dá)可能也是通過(guò)p38 MAPK介導(dǎo)。綜上所述,本研究的目的是探討MMP-9能否調(diào)節(jié)ACE的表達(dá)及其調(diào)節(jié)的信號(hào)通路是什么?為進(jìn)一步闡明MMP-9導(dǎo)致心血管重構(gòu)的機(jī)制提供新的依據(jù),為防治心血管疾病提供新的靶點(diǎn)。目的探討MMP-9是否通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞ACE的表達(dá)。材料與方法取3~5代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組,分為2個(gè)大組:模型組和干預(yù)組,具體如下:1.MMP-9對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上ACE蛋白表達(dá)的影響(模型組)3~5代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)分為4個(gè)小組:空白模型組、20ng/ml模型組、100ng/ml模型組及500ng/ml模型組。分別給予單純細(xì)胞培養(yǎng)液、重組人MMP-920ng/ml、重組人MMP-9 100ng/ml、重組人MMP-9 500ng/ml共孵育24h后,采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,Western blot法檢測(cè)細(xì)胞ACE和p38 MAPK蛋白表達(dá)。2.p38 MAPK阻斷劑預(yù)處理對(duì)MMP-9所增加的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上ACE蛋白表達(dá)的影響(干預(yù)組)3~5代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)分為4個(gè)小組:空白干預(yù)組、20ng/ml干預(yù)組、100ng/ml干預(yù)組及500ng/ml干預(yù)組。各組先給予SB203580(p38 MAPK阻斷劑)10umol/L預(yù)處理2h,然后再分別給予單純細(xì)胞培養(yǎng)液、重組人MMP-9 20ng/ml、重組人MMP-9 100ng/ml、重組人MMP-9 500ng/ml共孵育24h后,采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,Western blot法檢測(cè)細(xì)胞ACE蛋白表達(dá)。結(jié)果1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的變化經(jīng)過(guò)正常培養(yǎng)后,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,在倒置相差顯微鏡下觀察,細(xì)胞呈現(xiàn)圓形、卵圓形、梭形等形狀,呈單層“鋪路石”樣,細(xì)胞胞漿豐富,輪廓清晰,邊緣光滑。符合人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞鏡下特點(diǎn),可以作為進(jìn)一步探討MMP-9對(duì)ACE作用的研究模型。在模型組和干預(yù)組組內(nèi),不同濃度MMP-9與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24h后,在倒置相差顯微鏡下觀察,細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng),狀態(tài)良好,未見(jiàn)細(xì)胞明顯脫落。2.MMP-9對(duì)各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖均無(wú)影響在模型組和干預(yù)組組內(nèi),隨著MMP-9濃度增加,四個(gè)小組間的細(xì)胞增殖并無(wú)明顯差異(p0.05)。另外,模型組和干預(yù)組兩大組比較發(fā)現(xiàn),在p38 MAPK阻斷劑預(yù)處理后,干預(yù)組四個(gè)小組的細(xì)胞增殖和模型組中對(duì)應(yīng)的各個(gè)小組也均無(wú)明顯差異(p0.05)。3.MMP-9能夠增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞p38 MAPK蛋白的表達(dá)水平在模型組組內(nèi),不同濃度MMP-9與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24h后,隨著MMP-9濃度增加,各組p38 MAPK蛋白逐漸增加,100ng/ml模型組及500ng/ml模型組的p38MAPK蛋白表達(dá)量均明顯高于空白模型組(p0.01)。而20ng/ml模型組與空白模型組并無(wú)明顯差異(p0.05)。同時(shí),100ng/ml模型組的p38 MAPK蛋白表達(dá)量明顯高于20ng/ml模型組(p0.01),而500ng/ml模型組又明顯高于100ng/ml模型組(p0.01)。4.MMP-9能夠增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ACE蛋白的表達(dá)水平在模型組組內(nèi),不同濃度MMP-9與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24h后,隨著MMP-9濃度增加,各組ACE蛋白表達(dá)明顯增加,20ng/ml模型組、100ng/ml模型組及500ng/ml模型組的ACE表達(dá)量均明顯高于空白模型組(p0.01)。同時(shí),100ng/ml模型組的ACE蛋白表達(dá)量明顯高于20ng/ml模型組(p0.01),而500ng/ml模型組又明顯高于100ng/ml模型組(p0.01)。5.p38 MAPK阻斷劑明顯減低MMP-9所增加的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ACE蛋白的表達(dá)水平不同濃度MMP-9與SB203580(p38 MAPK阻斷劑)預(yù)處理后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24h后,干預(yù)組中的空白干預(yù)組、20ng/ml干預(yù)組、100ng/ml干預(yù)組及500ng/ml干預(yù)組的ACE蛋白表達(dá)均較模型組中對(duì)應(yīng)的各個(gè)小組明顯下降(p0.01)。另外,在干預(yù)組組內(nèi),隨著MMP-9濃度增加,各組ACE蛋白逐漸增加,100ng/ml干預(yù)組、500ng/ml干預(yù)組兩組ACE表達(dá)量均明顯高于空白干預(yù)組(p0.01)。而20ng/ml干預(yù)組與空白干預(yù)組并無(wú)明顯差異(p0.05)。同時(shí),100ng/ml干預(yù)組的ACE蛋白表達(dá)量明顯高于20ng/ml干預(yù)組(p0.01),而500ng/ml干預(yù)組又明顯高于100ng/ml干預(yù)組(p0.01)。結(jié)論MMP-9可以通過(guò)激活p38 MAPK信號(hào)通路上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)。
[Abstract]:Renin - angiotensin - aldosterone system ( RAAS ) is a key enzyme for the prevention and treatment of cardiovascular diseases . Renin - angiotensin - aldosterone system ( RAAS ) plays a key role in the regulation of cardiovascular diseases . Renin - angiotensin - aldosterone system ( RAAS ) is a key enzyme for RAAS . Matrix metalloproteinase - 9 ( MMP - 9 ) plays an important role in cardiovascular remodeling . The effects of MMP - 9 on the expression of ACE in human umbilical vein endothelial cells were investigated . The expression level of p38 MAPK protein in human umbilical vein endothelial cells was significantly higher than that in blank model group ( p0.01 ) .

【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R54

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊敏;陳淳媛;蔡姿麗;陳柏林;成亮;李輝;;病毒性心肌炎小鼠心肌基質(zhì)金屬蛋白酶-9的動(dòng)態(tài)變化及意義[J];中國(guó)當(dāng)代兒科雜志;2011年08期

2 王國(guó)軍;劉亞偉;李玉花;姜勇;;p38絲裂原活化蛋白激酶抑制劑研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通訊;2009年03期

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本文編號(hào)：1517921