本文關(guān)鍵詞： MMP-9 p38 MAPK 人臍靜脈內(nèi)皮細胞 ACE　出處：《廣東藥科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景心血管重構(gòu)(Cardiovascular remodeling)是心血管應(yīng)對多種心血管病導(dǎo)致的心肌和血管損害或負荷增加所產(chǎn)生的一系列不適當(dāng)結(jié)構(gòu)改變,是心力衰竭、高血壓等心血管疾病的重要病理基礎(chǔ)。研究心血管重構(gòu)的機制,對于防治心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensin-aldosterone System,RAAS)是一組存在于循環(huán)及組織里相互作用又相互影響的內(nèi)分泌系統(tǒng),在高血壓及心血管重構(gòu)等方面的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵性作用。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)是RAAS的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化酶,它能將血管緊張素Ⅰ(AngiotensinⅠ,AngⅠ)羧基端的二肽水解生成具有收縮血管作用的血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)。ACE在心血管重構(gòu)的作用主要是通過增加AngⅡ的生成實現(xiàn)的。循環(huán)的AngⅡ可以收縮血管和促進醛固酮分泌進而升高血壓;組織通過自分泌和旁分泌方式促進局部RAAS激活,組織的AngⅡ主要參與組織的重構(gòu)�；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一個可特異性降解細胞外基質(zhì)(Extracellar matrix,ECM)的鋅離子(Zn2+)依賴性肽鏈內(nèi)切酶家族�；|(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)是MMPs中的重要成員,廣泛分布于心血管系統(tǒng)中,參與多種生理和病理過程,包括胚泡著床、炎癥、潰瘍、心血管重構(gòu)等。在高血壓、心肌病及心肌梗死等心血管疾病中都存在著MMP-9增高的現(xiàn)象,增高的MMP-9可以促進ECM中的膠原成分分解,導(dǎo)致心室壁抵抗力下降,心臟擴張及心功能障礙等。雖然既往研究已顯示RAAS和MMPs各自對心血管重構(gòu)有著重要作用,但兩者的相互作用對心血管重構(gòu)的影響尚未完全明了。目前RAAS激活可以促進MMP-9的表達并導(dǎo)致心血管重構(gòu)的證據(jù)較多。例如,對小鼠輸注AngⅡ可以上調(diào)MMP-9表達,并出現(xiàn)心肌肥厚;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Angiotensin Converting Enzyme inhibitors,ACEI)類藥物抑制MMP-9的表達而逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)等。但關(guān)于MMP-9能否作用于RAAS導(dǎo)致心血管重構(gòu)的研究還比較有限。既往研究僅在體外實驗發(fā)現(xiàn),MMP-9可降解AngⅠ成為AngⅡ。我們課題組的前期實驗中發(fā)現(xiàn)注射外源性重組MMP-9后可引起大鼠血壓升高、心室重構(gòu),并且檢測到體內(nèi)ACE明顯增多。這提示,MMP-9可能可以上調(diào)ACE表達激活RAAS,從而引起或加重心血管重構(gòu)。如果MMP-9可以上調(diào)ACE表達,那它通過什么路徑介導(dǎo)呢?在眾多介導(dǎo)ACE表達的細胞內(nèi)信號通路中,以p38 MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)信號通路與之聯(lián)系最為緊密。p38 MAPK信號通道屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中的一員。MAPK是細胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是重要的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)之一,可以將細胞外刺激信號傳導(dǎo)至細胞胞質(zhì)及胞核內(nèi),參與細胞生理病理過程的調(diào)節(jié)。研究已證明,p38 MAPK可以介導(dǎo)上調(diào)ACE的表達,但未明確MMP-9是否也通過p38 MAPK信號通道上調(diào)ACE的表達。曾有實驗發(fā)現(xiàn),THP-1巨噬細胞在ox-LDL誘導(dǎo)下可增強p38 MAPK的表達,這種現(xiàn)象可以被MMP-9阻滯劑所抑制。因此我們推斷,MMP-9調(diào)節(jié)ACE的表達可能也是通過p38 MAPK介導(dǎo)。綜上所述,本研究的目的是探討MMP-9能否調(diào)節(jié)ACE的表達及其調(diào)節(jié)的信號通路是什么?為進一步闡明MMP-9導(dǎo)致心血管重構(gòu)的機制提供新的依據(jù),為防治心血管疾病提供新的靶點。目的探討MMP-9是否通過p38 MAPK信號通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞ACE的表達。材料與方法取3~5代人臍靜脈內(nèi)皮細胞進行實驗分組,分為2個大組:模型組和干預(yù)組,具體如下:1.MMP-9對人臍靜脈內(nèi)皮細胞上ACE蛋白表達的影響(模型組)3~5代人臍靜脈內(nèi)皮細胞隨機分為4個小組:空白模型組、20ng/ml模型組、100ng/ml模型組及500ng/ml模型組。分別給予單純細胞培養(yǎng)液、重組人MMP-920ng/ml、重組人MMP-9 100ng/ml、重組人MMP-9 500ng/ml共孵育24h后,采用CCK-8法檢測細胞增殖情況,Western blot法檢測細胞ACE和p38 MAPK蛋白表達。2.p38 MAPK阻斷劑預(yù)處理對MMP-9所增加的人臍靜脈內(nèi)皮細胞上ACE蛋白表達的影響(干預(yù)組)3~5代人臍靜脈內(nèi)皮細胞隨機分為4個小組:空白干預(yù)組、20ng/ml干預(yù)組、100ng/ml干預(yù)組及500ng/ml干預(yù)組。各組先給予SB203580(p38 MAPK阻斷劑)10umol/L預(yù)處理2h,然后再分別給予單純細胞培養(yǎng)液、重組人MMP-9 20ng/ml、重組人MMP-9 100ng/ml、重組人MMP-9 500ng/ml共孵育24h后,采用CCK-8法檢測細胞增殖情況,Western blot法檢測細胞ACE蛋白表達。結(jié)果1.人臍靜脈內(nèi)皮細胞形態(tài)的變化經(jīng)過正常培養(yǎng)后,人臍靜脈內(nèi)皮細胞生長狀態(tài)良好,在倒置相差顯微鏡下觀察,細胞呈現(xiàn)圓形、卵圓形、梭形等形狀,呈單層“鋪路石”樣,細胞胞漿豐富,輪廓清晰,邊緣光滑。符合人臍靜脈內(nèi)皮細胞鏡下特點,可以作為進一步探討MMP-9對ACE作用的研究模型。在模型組和干預(yù)組組內(nèi),不同濃度MMP-9與人臍靜脈內(nèi)皮細胞共孵育24h后,在倒置相差顯微鏡下觀察,細胞均貼壁生長,狀態(tài)良好,未見細胞明顯脫落。2.MMP-9對各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖均無影響在模型組和干預(yù)組組內(nèi),隨著MMP-9濃度增加,四個小組間的細胞增殖并無明顯差異(p0.05)。另外,模型組和干預(yù)組兩大組比較發(fā)現(xiàn),在p38 MAPK阻斷劑預(yù)處理后,干預(yù)組四個小組的細胞增殖和模型組中對應(yīng)的各個小組也均無明顯差異(p0.05)。3.MMP-9能夠增加人臍靜脈內(nèi)皮細胞p38 MAPK蛋白的表達水平在模型組組內(nèi),不同濃度MMP-9與人臍靜脈內(nèi)皮細胞共孵育24h后,隨著MMP-9濃度增加,各組p38 MAPK蛋白逐漸增加,100ng/ml模型組及500ng/ml模型組的p38MAPK蛋白表達量均明顯高于空白模型組(p0.01)。而20ng/ml模型組與空白模型組并無明顯差異(p0.05)。同時,100ng/ml模型組的p38 MAPK蛋白表達量明顯高于20ng/ml模型組(p0.01),而500ng/ml模型組又明顯高于100ng/ml模型組(p0.01)。4.MMP-9能夠增加人臍靜脈內(nèi)皮細胞ACE蛋白的表達水平在模型組組內(nèi),不同濃度MMP-9與人臍靜脈內(nèi)皮細胞共孵育24h后,隨著MMP-9濃度增加,各組ACE蛋白表達明顯增加,20ng/ml模型組、100ng/ml模型組及500ng/ml模型組的ACE表達量均明顯高于空白模型組(p0.01)。同時,100ng/ml模型組的ACE蛋白表達量明顯高于20ng/ml模型組(p0.01),而500ng/ml模型組又明顯高于100ng/ml模型組(p0.01)。5.p38 MAPK阻斷劑明顯減低MMP-9所增加的人臍靜脈內(nèi)皮細胞ACE蛋白的表達水平不同濃度MMP-9與SB203580(p38 MAPK阻斷劑)預(yù)處理后的人臍靜脈內(nèi)皮細胞共孵育24h后,干預(yù)組中的空白干預(yù)組、20ng/ml干預(yù)組、100ng/ml干預(yù)組及500ng/ml干預(yù)組的ACE蛋白表達均較模型組中對應(yīng)的各個小組明顯下降(p0.01)。另外,在干預(yù)組組內(nèi),隨著MMP-9濃度增加,各組ACE蛋白逐漸增加,100ng/ml干預(yù)組、500ng/ml干預(yù)組兩組ACE表達量均明顯高于空白干預(yù)組(p0.01)。而20ng/ml干預(yù)組與空白干預(yù)組并無明顯差異(p0.05)。同時,100ng/ml干預(yù)組的ACE蛋白表達量明顯高于20ng/ml干預(yù)組(p0.01),而500ng/ml干預(yù)組又明顯高于100ng/ml干預(yù)組(p0.01)。結(jié)論MMP-9可以通過激活p38 MAPK信號通路上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細胞血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的表達。
[Abstract]:Renin - angiotensin - aldosterone system ( RAAS ) is a key enzyme for the prevention and treatment of cardiovascular diseases . Renin - angiotensin - aldosterone system ( RAAS ) plays a key role in the regulation of cardiovascular diseases . Renin - angiotensin - aldosterone system ( RAAS ) is a key enzyme for RAAS . Matrix metalloproteinase - 9 ( MMP - 9 ) plays an important role in cardiovascular remodeling . The effects of MMP - 9 on the expression of ACE in human umbilical vein endothelial cells were investigated . The expression level of p38 MAPK protein in human umbilical vein endothelial cells was significantly higher than that in blank model group ( p0.01 ) .

【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R54

【參考文獻】

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