發(fā)布時間：2018-01-25 06:34

  本文關(guān)鍵詞： sDR5-Fc MI/R 炎性損傷 心功能 心肌纖維化　出處：《河南大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是對人類健康造成嚴(yán)重危害的心血管急危重癥。臨床治療AMI主要是梗死后在最短的時間內(nèi)進(jìn)行溶栓(尿激酶、鏈激酶等)和直接經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)(PCA),以減小梗死范圍,挽救因氧氣和能量供應(yīng)不足而瀕臨死亡的心肌細(xì)胞。而在AMI的治療和自然轉(zhuǎn)歸過程中,常伴發(fā)心肌缺血-再灌注損傷(MI/RI),引起更大范圍的心肌細(xì)胞死亡,主要是再灌注加速了嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞的死亡過程,并伴隨了以炎癥細(xì)胞浸潤和炎癥因子產(chǎn)生為特征的強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),最終可能導(dǎo)致心肌梗塞、纖維化、心肌肥厚和心力衰竭。近年來研究發(fā)現(xiàn),炎癥因子表達(dá)量的高低和缺血后心臟功能的損害與細(xì)胞壞死數(shù)量的多少密切相關(guān),并在其中起了非常重要的作用。眾多基礎(chǔ)實驗結(jié)果證實,通過藥物拮抗炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展可以有效下調(diào)炎癥反應(yīng),從而改善缺血-再灌注損傷(I/RI)。在大鼠心肌缺血-再灌注(MI/R)模型中,Fucoidan可以通過抑制炎癥通路的活化,同時減少炎癥介質(zhì)表達(dá)及促炎細(xì)胞的浸潤,減輕缺血-再灌注損傷來保護(hù)大鼠肝臟;Dongdong Sun等的研究也證明,Luteolin可以抑制MPO及炎癥因子包括IL-6,IL-1α及TNF-α的表達(dá),這些都有益于減少MI/R后心肌梗死面積,提高心功能。課題組經(jīng)過十余年的探索,發(fā)現(xiàn)TRAIL/DR5與心肌梗死密切相關(guān),前期利用酵母來源的人sDR5阻斷TRAIL/DR5通路可顯著減少模型大鼠的AMI心肌梗死面積,減輕心肌梗死程度,相關(guān)成果已獲批國家發(fā)明專利(專利號:ZL 201210442685.6)。此外,TRAIL可與其受體結(jié)合而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。為了延長體內(nèi)半衰期及增加療效,利于蛋白生產(chǎn)及純化,更好的向藥物開發(fā)轉(zhuǎn)化,我們進(jìn)一步將sDR5與人IgG1的Fc片段進(jìn)行融合,形成sDR5-Fc抗體融合蛋白,并構(gòu)建sDR5-Fc抗體融合蛋白高表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,在哺乳動物細(xì)胞CHO中進(jìn)行大規(guī)模表達(dá)、純化,得到產(chǎn)量高、活性好的sDR5-Fc抗體融合蛋白。并推測,sDR5-Fc蛋白可通過阻斷TRAIL,并抑制炎癥反應(yīng),改善心肌缺血-再灌注引起的炎性損傷,限制心肌梗死面積的擴(kuò)大從而保護(hù)心肌細(xì)胞。我們在已有報道和實驗室前期研究基礎(chǔ)上,通過建立心肌缺血-再灌注大鼠模型,檢測sDR5-Fc對心肌梗死面積的影響以及炎癥因子表達(dá)、炎癥細(xì)胞浸潤和心肌纖維化情況,探討炎癥反應(yīng)在心肌缺血-再灌注大鼠模型中發(fā)揮的效應(yīng)及sdr5-fc對其的作用,綜合評價人sdr5-fc蛋白作為新型心肌梗死治療藥物的可行性。為進(jìn)一步揭示心肌缺血-再灌注損傷機(jī)制提供實驗基礎(chǔ),為有效防治mi/r開辟新思路。目的:建立大鼠心肌缺血-再灌注模型,從大鼠心臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、蛋白水平、rna水平及組織學(xué)等方面探討sdr5-fc對大鼠心肌缺血-再灌注(mi/r)的保護(hù)作用及相關(guān)炎癥機(jī)制。方法:1、建模及取材:我們選擇8周齡的wistar雄性大鼠,將實驗鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為三組,通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支使其心肌缺血,并在1h后松開結(jié)扎線行再灌注處理,建立大鼠急性心肌缺血-再灌注模型,并對各組大鼠給予相應(yīng)處理:藥物組(sdr5-fc,16mg/kg)、磷酸鹽緩沖液組(phosphatebuffersolution,pbs和假手術(shù)(sham)組(只開胸不結(jié)扎,其他處理同pbs組)。同時在再灌注后3h、24h及2w時剝離心臟獲取結(jié)扎線下方的心臟組織。2、模型及用藥效果鑒定:通過伊文氏藍(lán)-2,3,5-氯化三苯基四氮唑(evansblue-2,3,5-triphenyltetrzoliumchloride,evansblue-ttc)雙色染色法檢測心肌梗死面積;利用蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin,he)檢測組織切片中心肌組織的形態(tài)結(jié)構(gòu);3、模型中炎癥因子表達(dá)情況檢測:通過實時定量pcr(rt-pcr)及免疫印跡法(westernblot,wb)測定心肌組織中tnf-α、il-1β、il-6等炎癥因子的表達(dá);用quantityone軟件對wb結(jié)果進(jìn)行半定量分析。4、模型中炎癥細(xì)胞浸潤情況檢測:通過免疫組織化學(xué)法(immunohistocheistry,ihc)檢測心肌中巨噬細(xì)胞、t淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤情況;5、心功能檢測:通過超聲心動圖檢測心肌缺血1小時-再灌注2周(i1h-r2w)的大鼠心功能;6、心肌纖維化檢測:通過masson三色染色法檢測心肌缺血1小時-再灌注2周的心肌纖維化情況。結(jié)果:1、成功建立急性mi/r大鼠模型。2、he染色檢測大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化可見pbs組梗死部位出現(xiàn)心肌細(xì)胞排列紊亂,有的細(xì)胞出現(xiàn)核破碎,心肌橫紋消失;與pbs組相比較,i/r+sdr5-fc組梗死區(qū)域的心肌細(xì)胞呈梭形排列,較為整齊有序,心肌橫紋明顯。3、RT-PCR檢測心肌組織中炎癥因子mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示,PBS組的TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)較Sham組上調(diào);與PBS組相比,注射sDR5-Fc組大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)下調(diào)。4、Western blotting檢測心肌組織中炎癥因子表達(dá),結(jié)果顯示,PBS組的TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)較Sham組上調(diào);與PBS組相比,注射sDR5-Fc組大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)下調(diào);與RT-PCR結(jié)果一致。5、免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),PBS組巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞浸潤比Sham組增多;而sDR5-Fc注射處理組的浸潤量減少。6、心肌缺血-再灌注2周,與Sham組相比,PBS組超聲心動圖顯示有明顯的心肌運(yùn)動平緩,心電圖顯示有ST段抬高;而sDR5-Fc組ST段恢復(fù)平穩(wěn),心功能較PBS組得到明顯改善。7、心肌缺血-再灌注2周,心肌纖維化,與Sham組相比,PBS組與sDR5-Fc組有明顯的心肌纖維化;用藥sDR5-Fc后心肌纖維化面積比PBS組明顯減少。結(jié)論:sDR5-Fc可以通過抑制心肌組織中炎癥因子分泌及炎癥細(xì)胞浸潤,減少大鼠心肌纖維化面積,從而減少缺血-再灌注后心肌梗死面積、改善大鼠心功能,發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞作用。
[Abstract]:Background : Acute myocardial infarction ( AMI ) is a serious risk to human health . The clinical treatment of AMI is mainly caused by myocardial infarction , fibrosis , myocardial hypertrophy and heart failure . Objective : To study the effects of sDR5 - fc on myocardial ischemia - reperfusion ( mi / r ) and to construct sDR5 - Fc antibody fusion protein . The expression of TNF - 偽 , IL - 1尾 , IL - 6 in myocardial tissue was detected by means of real - time quantitative polymerase chain reaction ( RT - PCR ) and Western blotting . The results showed that the expression of TNF - 偽 , IL - 1尾 , IL - 6 in myocardial tissue was regulated by means of quantitative polymerase chain reaction ( RT - PCR ) and Western blotting .

【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R542.22

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本文編號：1462263