本文關(guān)鍵詞：體外模擬內(nèi)皮功能異常及冠狀動(dòng)脈痙攣微環(huán)境下caveolin-1與NO及ET-1相關(guān)性的研究

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【摘要】：目的通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究致內(nèi)皮損傷物質(zhì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及致冠狀動(dòng)脈痙攣物質(zhì)乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）序貫作用的微環(huán)境下，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）表達(dá)caveolin-1與分泌一氧化氮(nitric oxide，NO)及內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）的相關(guān)性，初步探索caveolin-1是否在體外模擬內(nèi)皮功能異常導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈痙攣發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮病理生理作用。 方法 1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的分離、培養(yǎng)及鑒定。取無(wú)HIV、HBV感染，無(wú)妊娠期高血壓的健康孕婦剖腹產(chǎn)臍帶，在無(wú)菌環(huán)境中用0.1%I型膠原酶于37℃消化12min得到HUVEC，，接種于M199完全培養(yǎng)基(含20%胎牛血清、20ng/ml VEGF165、25μg/ml肝素、1%青鏈霉素雙抗)，37°C含5%CO2的溫箱培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)情況，免疫熒光法鑒定內(nèi)皮細(xì)胞的Ⅷ因子相關(guān)抗原。取3-5代的HUVEC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分五組：A.空白對(duì)照組（依據(jù)具體實(shí)驗(yàn)只加一定量的培養(yǎng)基與相應(yīng)試劑）；B.陰性對(duì)照組HUVEC；C.實(shí)驗(yàn)組①HUVEC+LPS；D.實(shí)驗(yàn)組②HUVEC+Ach；E.實(shí)驗(yàn)組③HUVEC+LPS+Ach。 2.脂多糖（LPS）構(gòu)建內(nèi)皮功能損傷模型：①CCK8（cell counting kit-8）法觀察LPS對(duì)HUVEC活性的影響，采用該法分別摸索LPS干預(yù)濃度梯度及時(shí)間梯度。②Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。③WST-1（一種高度水溶性四唑鹽）法測(cè)定檢測(cè)細(xì)胞上清液中超氧化物歧化酶(superoxide dimutase，SOD)的抑制率。 3.根據(jù)2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，LPS以50μg/ml24h及100μg/ml24h為干預(yù)條件處理HUVEC構(gòu)建內(nèi)皮損傷模型，以此細(xì)胞模型為基礎(chǔ)用10μmol/L乙酰膽堿（Ach）模擬冠脈痙攣微環(huán)境：①采用激光共聚焦技術(shù)，以熒光指示劑Fluo-3為探針，觀察Ach對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞[Ca2+]i水平的影響，用以評(píng)價(jià)冠脈痙攣模型是否構(gòu)建成功。②硝酸還原酶法測(cè)定細(xì)胞上清NO含量。③酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中ET-1含量。 ④Western-blot檢測(cè)細(xì)胞膜caveolin-1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 1.倒置熒光顯微鏡和免疫熒光結(jié)果顯示，I型膠原酶消化法可成功分離HUVEC，培養(yǎng)的HUVEC在3-5代細(xì)胞形態(tài)最為典型，增殖最快，活力最好，6代開始細(xì)胞形態(tài)趨于不規(guī)則，增殖減慢，活力逐漸下降。 2.實(shí)驗(yàn)組①與陰性對(duì)照組相比：1）CCK8結(jié)果表明，LPS較為合適的干預(yù)條件為50μg/ml24h(P 0.01)及100μg/ml24h (P 0.001)。2）Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組相比，LPS為50μg/ml24h(P0.05)及100μg/ml24h(P 0.001)干預(yù)HUVEC后凋亡率均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3)WST-1法檢測(cè)SOD抑制率結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組相比，LPS為50μg/ml24h(P 0.05)及100μg/ml24h(P 0.05)干預(yù)HUVEC后檢測(cè)細(xì)胞上清SOD抑制率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.根據(jù)2，LPS以50μg/ml24h及100μg/ml24h為干預(yù)條件處理HUVEC構(gòu)建內(nèi)皮損傷模型，此基礎(chǔ)上根據(jù)文獻(xiàn)資料選取10μmol/L濃度的Ach干預(yù)細(xì)胞： 1）與實(shí)驗(yàn)組②相比，實(shí)驗(yàn)組③LPS為50μg/ml24h組[Ca2+]i峰值平均水平降低不明顯（P0.05），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)組③LPS為100μg/ml24h組[Ca2+]i峰值平均水平降低明顯（P 0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2）硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清NO分泌量，與實(shí)驗(yàn)組②相比，實(shí)驗(yàn)組③LPS為50μg/ml24h(P 0.05)及100μg/ml24h(P 0.05)細(xì)胞上清NO分泌量均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3）ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清ET-1分泌量，與實(shí)驗(yàn)組②相比，實(shí)驗(yàn)組③LPS為50μg/ml24h(P 0.05)及100μg/ml24h(P0.05)細(xì)胞上清ET-1分泌量均明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4）Westernblot檢測(cè)HUVEC胞膜表面caveolin-1表達(dá)情況，與實(shí)驗(yàn)組②相比，實(shí)驗(yàn)組 ③LPS為50μg/ml24h組胞膜表面caveolin-1表達(dá)升高不明顯（P0.05），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)組③LPS為100μg/ml24h組胞膜表面caveolin-1表達(dá)升高明顯(P 0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 1.采用I型膠原酶消化法可成功分離HUVEC，并進(jìn)行體外培養(yǎng)及傳代，3-5代細(xì)胞最適合用于實(shí)驗(yàn)研究。 2. LPS以50μg/ml24h及100μg/ml24h為干預(yù)條件處理HUVEC可導(dǎo)致細(xì)胞活性降低、凋亡率升高及SOD抑制率降低，可成功構(gòu)建內(nèi)皮損傷模型。 3.在內(nèi)皮損傷的基礎(chǔ)上以10μmol/L濃度的Ach處理HUVEC，[Ca2+]i峰值平均水平降低，可體外模擬冠脈痙攣微環(huán)境；同時(shí)可見，caveolin-1蛋白表達(dá)增多，NO分泌減少，ET-1分泌增多，caveolin-1蛋白表達(dá)與NO分泌呈負(fù)相關(guān)，與ET-1分泌呈正相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R541.4

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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本文編號(hào)：1286742