本文關(guān)鍵詞：過氧化物酶體增殖物激活受體δ激動(dòng)劑GW0742對同型半胱氨酸誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞p47phox的影響及機(jī)制

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【摘要】：目的:動(dòng)脈硬化是是臨床上的常見病與多發(fā)病,是一種會(huì)造成人們患上冠心病、腦血管病等,從而嚴(yán)重危害身體健康和生命的疾病。同型半胱氨酸可以通過不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活NADPH氧化酶,產(chǎn)生大量的ROS,導(dǎo)致一系列的病理和生理改變,是動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生的一個(gè)重要因素。PPARδ的激活,可能通過其抗氧化和抗炎的作用減少ROS的產(chǎn)生,防止血管內(nèi)皮組織功能紊亂的發(fā)生,從而限制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展,將來它可能會(huì)成為預(yù)防和治療動(dòng)脈硬化的新靶點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中,我們應(yīng)用HCY干預(yù)EA.hy926細(xì)胞誘導(dǎo)氧化應(yīng)激發(fā)生,并應(yīng)用GW0742干預(yù)細(xì)胞作為對照,觀察p47phox m RNA,P-p38MAPK、P-p47phox和PPARδ蛋白水平的改變,探討PPARδ抑制氧化應(yīng)激的機(jī)制。方法:1.EA.hy926細(xì)胞傳代培養(yǎng)。2.細(xì)胞無血清培養(yǎng)24h后,使用同型半胱氨酸(50μM)對細(xì)胞進(jìn)行刺激30min。提取總RNA,RT-PCR法測定p47phox m RNA的表達(dá)量。3.細(xì)胞無血清培養(yǎng)24h后,使用同型半胱氨酸(50μM)在不同的時(shí)間(0-40min)對細(xì)胞進(jìn)行刺激。提取總蛋白,Western blot測定p47phox的磷酸化水平。4.細(xì)胞無血清培養(yǎng)24h后,A組實(shí)驗(yàn)使用同型半胱氨酸(50μM)在不同的時(shí)間(0-60min)對細(xì)胞進(jìn)行刺激;B組實(shí)驗(yàn)使用GW0742(1μM)預(yù)處理細(xì)胞30min,再使用同型半胱氨酸(50μM)對細(xì)胞刺30min。用氧化還原敏感的熒光染料DCFH-DA干預(yù)細(xì)胞,然后用熒光顯微鏡測定細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。\5.細(xì)胞無血清培養(yǎng)24h后,使用同型半胱氨酸(50μM)在不同的時(shí)間(0-40min)對細(xì)胞進(jìn)行刺激。提取總蛋白,Western blot測定PPARδ的蛋白水平。6.細(xì)胞無血清培養(yǎng)24h后,使用或不使用GW0742(1μM)或GSK(1μM)預(yù)處理細(xì)胞30min,再使用或不使用HCY(50μM)刺激細(xì)胞30min。提取總蛋白,Western blot測定PPARδ的蛋白水平。7.細(xì)胞無血清培養(yǎng)24h后,細(xì)胞使用GW0742(1μM)預(yù)處理,然后使用HCY(50μM)刺激30min,或單獨(dú)使用兩種藥物干預(yù)30min。提取總蛋白,Western blot測定p38MAPK的磷酸化水平。8.細(xì)胞無血清培養(yǎng)24h后,細(xì)胞使用GW0742(1μM)或SB203580(20μM)預(yù)處理細(xì)胞30min,然后使用HCY(50μM)刺激細(xì)胞30min。提取總蛋白,Western blot測定p47phox的磷酸化水平。結(jié)果:1.EA.hy926是人類內(nèi)皮細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞系,具有與原始內(nèi)皮細(xì)胞相同的形態(tài)學(xué)分布生物學(xué)活性。2.同型半胱氨酸可以明顯增加p47phox m RNA在EA.hy926的表達(dá)。3.同型半胱氨酸呈時(shí)間依賴性增加p47phox的磷酸化,各組分別是空白對照組的1.25、1.45、1.55、1.2倍,當(dāng)刺激時(shí)間為30min時(shí)達(dá)最高峰。4.同型半胱氨酸呈時(shí)間依賴性地增加活性氧的產(chǎn)生,各組分別是空白對照組的1.1、1.5、2.1、1.8倍,當(dāng)HCY刺激時(shí)間為30min時(shí),活性氧的產(chǎn)生達(dá)到最高峰;PPARδ激活明顯抑制活性氧的產(chǎn)生。5.同型半胱氨酸呈時(shí)間依賴性增加PPARδ的表達(dá),各組分別是空白對照組的1.06、1.1、1.25、1.02倍,當(dāng)刺激時(shí)間為30min時(shí)達(dá)最高峰。6.單獨(dú)使用同型半胱氨酸和GW0742不同程度地增加PPARδ表達(dá),而在同型半胱氨酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中,GW0742能顯著地增加PPARδ的表達(dá),各組分別是空白對照組的1.25、1.6、2、1.3、1.1倍。7.GW0742能夠抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)的p38MAPK的磷酸化,各組分別是空白對照組的2、1.5、1.05倍。8.同型半胱氨酸通過p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路增加p47phox的磷酸化;GW0742能減少p47phox的磷酸化,各組分別是空白對照組的1.4、1.1、0.9倍。結(jié)論:HCY通過p38MAPK通路引起p47phox的磷酸化增加ROS,GW0742在HCY誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中顯著增加PPARδ,進(jìn)而減少p38MAPK和p47phox的磷酸化,降低ROS的產(chǎn)生。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R543.5

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本文編號(hào)：1286245