本文關(guān)鍵詞：基于血管新生與成熟的Hif-1α信號機(jī)制揭示黃芪甲苷Ⅳ治療心肌梗死的新機(jī)制

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【摘要】：缺血性心臟疾病是嚴(yán)重威脅著人類健康，其病理特點(diǎn)是血管的狹窄或阻塞，導(dǎo)致病理血管附近的心肌組織缺血壞死�，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于缺血性心臟病的治療重在快速建立有效循環(huán)，挽救可逆性心肌組織，最大程度的保護(hù)心臟的“泵血”能力，降低致死率。目前，由于經(jīng)皮冠脈內(nèi)介入治療、冠狀動脈旁路移植術(shù)等治療有創(chuàng)傷性，以及在彌漫性病變患者中上述治療方法存在局限性，治療性血管再生術(shù)已成為治療缺血性疾病領(lǐng)域的研究新方向。雖然大量臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的都在不斷提高治療性血管再生術(shù)的療效，但其療效的穩(wěn)定性、安全性以及可操作性、藥物性價(jià)比都是擺在研究者面前的難題。 按照中醫(yī)理論對心梗病理病機(jī)的認(rèn)識，心氣虛是其最常見和最早出現(xiàn)的證候。有學(xué)者認(rèn)為不同程度的心肌梗死患者都有心氣虛存在,心功能低下與心氣虛密切相關(guān)。黃芪甲苷IV是從傳統(tǒng)益氣中藥黃芪中提取的一種皂苷類的單體，是黃芪的主要有效成分，且被廣泛應(yīng)用于治療缺血性疾病。且有學(xué)者通過體外血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已初步證實(shí)黃芪甲苷IV可通過活化PI3K-AKT信號通路激活Hif-1α，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和體外管腔的形成。但黃芪甲苷IV治療心肌梗死的作用、對血管新生與成熟的影響以及其與Hif-1α機(jī)制的相關(guān)性尚不明確。據(jù)此，故本實(shí)驗(yàn)以益氣法理論為基礎(chǔ)，采用中西醫(yī)結(jié)合的思考路線，研究具有益氣藥功效的黃芪的有效成分黃芪甲苷IV是否通過上調(diào)Hif-1α的表達(dá)促進(jìn)心梗周邊組織血管的新生和成熟來促進(jìn)心梗的恢復(fù)。我們的研究旨在為治療性血管再生術(shù)的研究開辟新視角。 實(shí)驗(yàn)一黃芪甲苷IV對心肌梗死小鼠的治療作用 1.目的 研究黃芪甲苷IV對心肌梗死小鼠的治療作用。 2.方法 （1）建立小鼠心梗模型后，每日腹腔注射給藥，并記錄小鼠生命體征，21天后通過小鼠心動超檢測小鼠心功能的變化. （2）Masson三色染色法檢測心肌梗死后小鼠的心肌纖維化的程度。 （3）CD31、α-SMA熒光染色觀察梗死周邊心肌組織新生血管的變化. （4）鼠尾注射生物標(biāo)記素Lectin后取材切片行熒光染色觀察梗死周邊心肌組織新生血管的灌注情況。 （5）Western blot檢測心肌組織Hif-1α和VEGF蛋白表達(dá)的變化。 3.結(jié)果 （1）黃芪甲苷IV對小鼠心功能的影響：心動超聲圖提示：與心梗對照組比較，每日腹腔注射黃芪甲苷IV可提高心梗小鼠的左心射血分?jǐn)?shù)（61±2.7%）和左心室短軸收縮率（44±.3.2%），且差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01)。 （2）黃芪甲苷IV對小鼠心肌纖維化的影響：與心梗對照組纖維化面積（17.5±2.3%）比較，每日腹腔注射黃芪甲苷IV治療組小鼠心肌纖維化面積（7.8±2.4%）減小，且差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01)。 （3）黃芪甲苷IV對心梗組織周邊新生血管的影響：與心梗對照組比較，每日腹腔注射黃芪甲苷IV可顯著提高CD31陽性的小血管的密度（214±21.3/mm2)以及有平滑肌細(xì)胞被覆的CD31和α-SMA雙陽性的成熟血管的密度(7±2.1/mm2)且差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01)。 （4）黃芪甲苷IV對心梗周邊心肌組織中血管灌注能力的影響：與心梗對照組(0.19±0.07×104/pixels）比較，每日腹腔注射黃芪甲苷IV可顯著提高生物標(biāo)記素Lectin陽性的有灌注能力的血管密度(0.39±0.11×104/pixels），且差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01)。 （5）黃芪甲苷IV對心梗后心肌組織Hif-1α和VEGF蛋白表達(dá)的影響：與心梗組比較，黃芪甲苷IV可上調(diào)梗死周邊心肌組織Hif-1α和VEGF蛋白的表達(dá)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01)。 4.結(jié)論 （1）黃芪甲苷IV治療后可提高小鼠的左心射血分?jǐn)?shù)和左心室短軸收縮率，提高心臟功能,減小心梗小鼠心肌纖維化程度。 （2）黃芪甲苷IV治療后可增加梗死心肌周邊心肌組織新生血管的密度及有平滑肌細(xì)胞被覆的成熟血管的密度,且可提高有灌溉能力的血管密度。 （3）黃芪甲苷IV可促進(jìn)梗死心肌周邊組織中Hif-1α和VEGF蛋白的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)二黃芪甲苷IV對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞活性和形成管腔能力的影響 1.目的 觀察黃芪甲苷IV對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞活性和形成管腔能力的影響。 2.方法 （1）MTT檢測不同濃度黃芪甲苷IV對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響。 （2）流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測黃芪甲苷IV對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞周期和凋亡的影響。 （3）體外平面管腔實(shí)驗(yàn)檢測黃芪甲苷IV對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力的影響。三維磁珠管腔形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測黃芪甲苷IV對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力的影響。 （4）Western blot檢測黃芪甲苷IV對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞Hif-1α和VEGF蛋白表達(dá)的影響。 3.結(jié)果 （1）不同濃度黃芪甲苷IV在對缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響：從0.125μΜ到0.5μΜ隨著濃度的提高，與對照組相比，黃芪甲苷IV可提高缺氧內(nèi)皮細(xì)胞的活性，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01)。 （2）黃芪甲苷IV對缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞增殖和凋亡的影響：與對照組比較，黃芪甲苷IV處理組缺氧血管內(nèi)皮細(xì)胞處于G2和S期的比值明顯增大，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01)；且與對照組比較，黃芪甲苷IV處理組缺氧的血管內(nèi)皮細(xì)胞中早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞比例數(shù)都明顯減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01)。 （3）黃芪甲苷IV對缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力的影響：缺氧條件下，缺氧組內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力明顯下降，但在黃芪甲苷IV處理后，缺氧血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔的數(shù)量（18±3.1/field)明顯提高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01)。且三維管腔形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步提示：與對照組比較，在黃芪甲苷IV處理后，缺氧內(nèi)皮細(xì)胞通過出芽形成管腔的密度(7±1.7/beads)明顯提高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01)。 （4）黃芪甲苷IV對缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Hif-1α和VEGF蛋白表達(dá)的影響：與對照組比較，黃芪甲苷IV處理組可顯著提高缺氧內(nèi)皮細(xì)胞Hif-1α和VEGF蛋白的表達(dá)，差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01)。 4.結(jié)論 （1）黃芪甲苷IV可抑制缺氧內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其增殖。 （2）黃芪甲苷IV可促進(jìn)缺氧內(nèi)皮細(xì)胞形成血管管腔。 （3）黃芪甲苷IV在可上調(diào)缺氧內(nèi)皮細(xì)胞Hif-1α和VEGF蛋白的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)三黃芪甲苷IV抑制缺血心肌細(xì)胞損傷的Hif-1α信號機(jī)制 1.目的 研究黃芪甲苷IV抑制缺血心肌細(xì)胞損傷的Hif-1α信號機(jī)制。 2.方法 （1）原代心肌細(xì)胞的提取和培養(yǎng)；LDH的測定黃芪甲苷IV和Hif-1α siRNA對缺血心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。 （2）流式細(xì)胞術(shù)檢測黃芪甲苷IV和Hif-1α siRNA對缺血心肌細(xì)胞的凋亡的影響。 （3）Quantitative PCR和Western blot檢測黃芪甲苷IV和Hif-1α siRNA對缺血心肌細(xì)胞Hif-1α和VEGF蛋白表達(dá)水平的影響。 3.結(jié)果 （1）黃芪甲苷IV對缺血心肌細(xì)胞凋亡的影響：與缺血對照組(34.3±3.7%)比較，黃芪甲苷IV處理組后，缺血心肌細(xì)胞的凋亡可減少(17.8±2.8%),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01)；對細(xì)胞進(jìn)行Hif-1α siRNA轉(zhuǎn)染后，與轉(zhuǎn)染非特異siRNA對照組比較，缺血細(xì)胞的凋亡有增加趨勢，但差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在加入黃芪甲苷IV處理后，與轉(zhuǎn)染Hif-1α siRNA(35.6±3.4%%)對照組比較，缺血細(xì)胞的凋亡無明顯減少，且差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 （2）黃芪甲苷IV對缺血心肌細(xì)胞LDH釋放量的影響：與缺血對照組比較，黃芪甲苷IV處理組可降低LDH釋放,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01)；對細(xì)胞進(jìn)行Hif-1αsiRNA轉(zhuǎn)染后，與轉(zhuǎn)染非特異siRNA對照組比較，缺血細(xì)胞的LDH釋放有增加趨勢，但差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在加入黃芪甲苷IV處理后，與轉(zhuǎn)染Hif-1α siRNA對照組比較,LDH釋放無明顯減少，且差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (3)黃芪甲苷IV對缺血心肌細(xì)胞Hif-1α和VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響：與缺血對照組比較，黃芪甲苷IV處理組可上調(diào)Hif-1α和VEGF mRNA和蛋白,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01)。對細(xì)胞進(jìn)行Hif-1α siRNA轉(zhuǎn)染后，與轉(zhuǎn)染非特異siRNA對照組比較，Hif-1α和VEGF mRNA和蛋白明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01)，而且在加入黃芪甲苷IV處理后，，與轉(zhuǎn)染Hif-1α siRNA對照組比較,Hif-1α和VEGFmRNA和蛋白無明顯上調(diào)，且差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.結(jié)論 黃芪甲苷IV在缺血條件下可抑制心肌細(xì)胞的凋亡，減少LDH的釋放，保護(hù)心肌細(xì)胞，但是在轉(zhuǎn)染了Hif-1α siRNA可抵消黃芪甲苷IV抑制缺血心肌細(xì)胞損傷作用。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R542.22

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本文編號：1251523