本文關鍵詞：基于血管新生與成熟的Hif-1α信號機制揭示黃芪甲苷Ⅳ治療心肌梗死的新機制

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【摘要】：缺血性心臟疾病是嚴重威脅著人類健康，其病理特點是血管的狹窄或阻塞，導致病理血管附近的心肌組織缺血壞死�，F(xiàn)代醫(yī)學對于缺血性心臟病的治療重在快速建立有效循環(huán)，挽救可逆性心肌組織，最大程度的保護心臟的“泵血”能力，降低致死率。目前，由于經(jīng)皮冠脈內介入治療、冠狀動脈旁路移植術等治療有創(chuàng)傷性，以及在彌漫性病變患者中上述治療方法存在局限性，治療性血管再生術已成為治療缺血性疾病領域的研究新方向。雖然大量臨床和基礎實驗的都在不斷提高治療性血管再生術的療效，但其療效的穩(wěn)定性、安全性以及可操作性、藥物性價比都是擺在研究者面前的難題。 按照中醫(yī)理論對心梗病理病機的認識，心氣虛是其最常見和最早出現(xiàn)的證候。有學者認為不同程度的心肌梗死患者都有心氣虛存在,心功能低下與心氣虛密切相關。黃芪甲苷IV是從傳統(tǒng)益氣中藥黃芪中提取的一種皂苷類的單體，是黃芪的主要有效成分，且被廣泛應用于治療缺血性疾病。且有學者通過體外血管內皮細胞實驗已初步證實黃芪甲苷IV可通過活化PI3K-AKT信號通路激活Hif-1α，從而促進血管內皮細胞的增殖和體外管腔的形成。但黃芪甲苷IV治療心肌梗死的作用、對血管新生與成熟的影響以及其與Hif-1α機制的相關性尚不明確。據(jù)此，故本實驗以益氣法理論為基礎，采用中西醫(yī)結合的思考路線，研究具有益氣藥功效的黃芪的有效成分黃芪甲苷IV是否通過上調Hif-1α的表達促進心梗周邊組織血管的新生和成熟來促進心梗的恢復。我們的研究旨在為治療性血管再生術的研究開辟新視角。 實驗一黃芪甲苷IV對心肌梗死小鼠的治療作用 1.目的 研究黃芪甲苷IV對心肌梗死小鼠的治療作用。 2.方法 （1）建立小鼠心梗模型后，每日腹腔注射給藥，并記錄小鼠生命體征，21天后通過小鼠心動超檢測小鼠心功能的變化. （2）Masson三色染色法檢測心肌梗死后小鼠的心肌纖維化的程度。 （3）CD31、α-SMA熒光染色觀察梗死周邊心肌組織新生血管的變化. （4）鼠尾注射生物標記素Lectin后取材切片行熒光染色觀察梗死周邊心肌組織新生血管的灌注情況。 （5）Western blot檢測心肌組織Hif-1α和VEGF蛋白表達的變化。 3.結果 （1）黃芪甲苷IV對小鼠心功能的影響：心動超聲圖提示：與心梗對照組比較，每日腹腔注射黃芪甲苷IV可提高心梗小鼠的左心射血分數(shù)（61±2.7%）和左心室短軸收縮率（44±.3.2%），且差異具有明顯統(tǒng)計學意義（P0.01)。 （2）黃芪甲苷IV對小鼠心肌纖維化的影響：與心梗對照組纖維化面積（17.5±2.3%）比較，每日腹腔注射黃芪甲苷IV治療組小鼠心肌纖維化面積（7.8±2.4%）減小，且差異具有明顯統(tǒng)計學意義（P0.01)。 （3）黃芪甲苷IV對心梗組織周邊新生血管的影響：與心梗對照組比較，每日腹腔注射黃芪甲苷IV可顯著提高CD31陽性的小血管的密度（214±21.3/mm2)以及有平滑肌細胞被覆的CD31和α-SMA雙陽性的成熟血管的密度(7±2.1/mm2)且差異具有明顯統(tǒng)計學意義（P0.01)。 （4）黃芪甲苷IV對心梗周邊心肌組織中血管灌注能力的影響：與心梗對照組(0.19±0.07×104/pixels）比較，每日腹腔注射黃芪甲苷IV可顯著提高生物標記素Lectin陽性的有灌注能力的血管密度(0.39±0.11×104/pixels），且差異具有明顯統(tǒng)計學意義（P0.01)。 （5）黃芪甲苷IV對心梗后心肌組織Hif-1α和VEGF蛋白表達的影響：與心梗組比較，黃芪甲苷IV可上調梗死周邊心肌組織Hif-1α和VEGF蛋白的表達，且差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01)。 4.結論 （1）黃芪甲苷IV治療后可提高小鼠的左心射血分數(shù)和左心室短軸收縮率，提高心臟功能,減小心梗小鼠心肌纖維化程度。 （2）黃芪甲苷IV治療后可增加梗死心肌周邊心肌組織新生血管的密度及有平滑肌細胞被覆的成熟血管的密度,且可提高有灌溉能力的血管密度。 （3）黃芪甲苷IV可促進梗死心肌周邊組織中Hif-1α和VEGF蛋白的表達。 實驗二黃芪甲苷IV對缺氧內皮細胞活性和形成管腔能力的影響 1.目的 觀察黃芪甲苷IV對缺氧內皮細胞活性和形成管腔能力的影響。 2.方法 （1）MTT檢測不同濃度黃芪甲苷IV對缺氧內皮細胞活性的影響。 （2）流式細胞術進一步檢測黃芪甲苷IV對缺氧內皮細胞周期和凋亡的影響。 （3）體外平面管腔實驗檢測黃芪甲苷IV對缺氧內皮細胞管腔形成能力的影響。三維磁珠管腔形成實驗進一步檢測黃芪甲苷IV對缺氧內皮細胞管腔形成能力的影響。 （4）Western blot檢測黃芪甲苷IV對缺氧內皮細胞Hif-1α和VEGF蛋白表達的影響。 3.結果 （1）不同濃度黃芪甲苷IV在對缺氧臍靜脈內皮細胞活性的影響：從0.125μΜ到0.5μΜ隨著濃度的提高，與對照組相比，黃芪甲苷IV可提高缺氧內皮細胞的活性，且差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01)。 （2）黃芪甲苷IV對缺氧臍靜脈內皮細胞細胞增殖和凋亡的影響：與對照組比較，黃芪甲苷IV處理組缺氧血管內皮細胞處于G2和S期的比值明顯增大，且差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01)；且與對照組比較，黃芪甲苷IV處理組缺氧的血管內皮細胞中早期凋亡和晚期凋亡的細胞比例數(shù)都明顯減少，且差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01)。 （3）黃芪甲苷IV對缺氧臍靜脈內皮細胞管腔形成能力的影響：缺氧條件下，缺氧組內皮細胞管腔形成能力明顯下降，但在黃芪甲苷IV處理后，缺氧血管內皮細胞形成管腔的數(shù)量（18±3.1/field)明顯提高，且差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01)。且三維管腔形成實驗進一步提示：與對照組比較，在黃芪甲苷IV處理后，缺氧內皮細胞通過出芽形成管腔的密度(7±1.7/beads)明顯提高，且差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01)。 （4）黃芪甲苷IV對缺氧臍靜脈內皮細胞Hif-1α和VEGF蛋白表達的影響：與對照組比較，黃芪甲苷IV處理組可顯著提高缺氧內皮細胞Hif-1α和VEGF蛋白的表達，差異具有明顯的統(tǒng)計學意義（P0.01)。 4.結論 （1）黃芪甲苷IV可抑制缺氧內皮細胞的凋亡，促進其增殖。 （2）黃芪甲苷IV可促進缺氧內皮細胞形成血管管腔。 （3）黃芪甲苷IV在可上調缺氧內皮細胞Hif-1α和VEGF蛋白的表達。 實驗三黃芪甲苷IV抑制缺血心肌細胞損傷的Hif-1α信號機制 1.目的 研究黃芪甲苷IV抑制缺血心肌細胞損傷的Hif-1α信號機制。 2.方法 （1）原代心肌細胞的提取和培養(yǎng)；LDH的測定黃芪甲苷IV和Hif-1α siRNA對缺血心肌細胞的保護作用。 （2）流式細胞術檢測黃芪甲苷IV和Hif-1α siRNA對缺血心肌細胞的凋亡的影響。 （3）Quantitative PCR和Western blot檢測黃芪甲苷IV和Hif-1α siRNA對缺血心肌細胞Hif-1α和VEGF蛋白表達水平的影響。 3.結果 （1）黃芪甲苷IV對缺血心肌細胞凋亡的影響：與缺血對照組(34.3±3.7%)比較，黃芪甲苷IV處理組后，缺血心肌細胞的凋亡可減少(17.8±2.8%),且差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01)；對細胞進行Hif-1α siRNA轉染后，與轉染非特異siRNA對照組比較，缺血細胞的凋亡有增加趨勢，但差異無明顯統(tǒng)計學意義。但在加入黃芪甲苷IV處理后，與轉染Hif-1α siRNA(35.6±3.4%%)對照組比較，缺血細胞的凋亡無明顯減少，且差異不具有統(tǒng)計學意義。 （2）黃芪甲苷IV對缺血心肌細胞LDH釋放量的影響：與缺血對照組比較，黃芪甲苷IV處理組可降低LDH釋放,差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01)；對細胞進行Hif-1αsiRNA轉染后，與轉染非特異siRNA對照組比較，缺血細胞的LDH釋放有增加趨勢，但差異無明顯統(tǒng)計學意義，但在加入黃芪甲苷IV處理后，與轉染Hif-1α siRNA對照組比較,LDH釋放無明顯減少，且差異不具有統(tǒng)計學意義。 (3)黃芪甲苷IV對缺血心肌細胞Hif-1α和VEGF mRNA和蛋白表達的影響：與缺血對照組比較，黃芪甲苷IV處理組可上調Hif-1α和VEGF mRNA和蛋白,差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01)。對細胞進行Hif-1α siRNA轉染后，與轉染非特異siRNA對照組比較，Hif-1α和VEGF mRNA和蛋白明顯下調，差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01)，而且在加入黃芪甲苷IV處理后，，與轉染Hif-1α siRNA對照組比較,Hif-1α和VEGFmRNA和蛋白無明顯上調，且差異不具有統(tǒng)計學意義。 4.結論 黃芪甲苷IV在缺血條件下可抑制心肌細胞的凋亡，減少LDH的釋放，保護心肌細胞，但是在轉染了Hif-1α siRNA可抵消黃芪甲苷IV抑制缺血心肌細胞損傷作用。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R542.22

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本文編號：1251523