本文關(guān)鍵詞：超聲靶向破壞微泡增強microRNA-21轉(zhuǎn)染豬心肌組織的研究

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【摘要】：目的超聲靶向破壞微泡(Ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD)作為一項高效、安全、具有靶向性的非病毒基因傳輸技術(shù),已成功應(yīng)用于體外及小動物研究。然而,UTMD介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染大動物心肌組織的可行性、轉(zhuǎn)染條件及其效果如何,目前國內(nèi)外少有研究報道。本研究擬探討UTMD介導(dǎo)microRNA-21 (miR-21)轉(zhuǎn)染豬心肌的可行性并進一步優(yōu)化其轉(zhuǎn)染參數(shù)。方法構(gòu)建miR-21真核表達質(zhì)粒并體外轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細胞以檢測其表達活性。我們首先優(yōu)化UTMD介導(dǎo)miR-21轉(zhuǎn)染豬心肌組織的適宜輻照強度。經(jīng)耳緣靜脈給予載基因超聲微泡(miR-21/MB),同時以不同超聲強度(1W/cm2,2W/cm2,3W/cm2)輻照左室前壁直至微泡消失。待研究得出適宜輻照強度后進一步探討UTMD介導(dǎo)miR-21經(jīng)靜脈與冠脈轉(zhuǎn)染豬心肌組織的效果。分別經(jīng)耳緣靜脈及冠脈左前降支(LAD)給予miR-21/MB,同時經(jīng)胸進行超聲輻照；以單純PBS注射組(空白對照組)、單純靜脈或冠脈注射miR-21/MB而不予超聲輻照組作為對照。采用心臟超聲評價心功能,以電化學(xué)發(fā)光法(ELC)檢測血清肌鈣蛋白I (cTnI)水平；術(shù)后4天取左室前壁心肌組織,冰凍切片熒光顯微鏡下觀察心肌組織增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達情況,石蠟切片HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變,分別采用實時熒光定量PCR (FQ-PCR)和蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測心肌組織miR-21及其靶基因PDCD4的表達水平。結(jié)果miR-21重組質(zhì)粒構(gòu)建成功并可在真核細胞內(nèi)有效表達。應(yīng)用心臟超聲在術(shù)前及術(shù)后不同時間點(3h,12h,24h,4d)檢測心功能,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同強度超聲輻照(1 W/cm2,2W/cm2,3W/cm2)各組心功能指標(LVEF,FS, CO及LVEDd)均未見明顯動態(tài)改變,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。血清cTnI動態(tài)檢測結(jié)果顯示,3W/cm2超聲輻照組血清cTnI水平呈動態(tài)改變,術(shù)后3h開始升高,12h達高峰,此后逐漸下降并于術(shù)后4d回到基線水平(P0.05)。1W/cm2及2W/cm2超聲輻照組術(shù)后不同時間點血清cTnI水平均未見明顯改變,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。HE染色結(jié)果顯示不同強度超聲輻照各組心肌組織形態(tài)保持完好,未見心肌壞死、出血以及炎癥反應(yīng)等。FQ-PCR結(jié)果表明與1W/cm2、3W/cm2超聲輻照組相比,2W/cm2超聲輻照心肌組織miR-21表達水平較高(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示與1W/cm2超聲輻照組相比,2 W/cm2、3W/cm2超聲輻照均可顯著抑制心肌組織PDCD4表達,尤以2W/cm2超聲輻照組明顯(P0.05)。UTMD介導(dǎo)miR-21經(jīng)靜脈與冠脈轉(zhuǎn)染豬心肌,冰凍切片熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)空白對照組心肌組織未見EGFP表達；單純靜脈或冠脈給予miR-21/MB, EGFP表達主要位于心內(nèi)膜下及血管周圍；聯(lián)合超聲輻照后,心肌組織可見明顯EGFP表達。FQ-PCR結(jié)果顯示與空白對照組相比,單純靜脈給予miR-21/MB并不能提高心肌組織miR-21表達(P0.05),單純冠脈給予miR-21/MB雖可提高心肌組織miR-21表達,但轉(zhuǎn)染效率仍然較低(P0.05)。與單純給予miR-21/MB相比,不論靜脈抑或冠脈內(nèi)給藥,UTMD均可顯著提高心肌組織miR-21表達(P0.05),其中冠脈給藥組稍高于靜脈給藥組,盡管其給藥劑量為靜脈組的一半(P0.05)。Western blot結(jié)果表明,單純靜脈給予miR-21/MB不能抑制PDCD4表達(P0.05)；單純冠脈給予miR-21/MB,心肌組織PDCD4表達稍有下降(P0.05)；而UTMD介導(dǎo)miR-21經(jīng)靜脈或冠脈轉(zhuǎn)染豬心肌可顯著抑制PDCD4表達(P0.05),尤以冠脈給藥組明顯(P0.05)。結(jié)論以強度2W/cm2,頻率1MHz,占空比50%,脈沖輻照20min,不論經(jīng)靜脈抑或冠脈途徑給藥,UTMD均可顯著增強外源基因轉(zhuǎn)染大動物心肌組織�？紤]到臨床應(yīng)用的簡便性、較小的侵入性以及較低的技術(shù)要求,靜脈內(nèi)給藥可能是更好的選擇。然而對于擬行經(jīng)皮冠脈介入治療的患者,冠脈內(nèi)給藥不失為另一種選擇。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2

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